劉月榮，陳曦，田野

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胞外囊泡對(duì)血管生成影響的研究進(jìn)展

劉月榮，陳曦，田野

150001 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科

胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是由不同細(xì)胞產(chǎn)生并釋放到細(xì)胞外的囊泡。最初被認(rèn)為是無(wú)生物學(xué)功能的細(xì)胞碎片，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)其在血管生成、免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。EVs 攜帶了許多表面受體、遺傳物質(zhì)、生物活性分子等，在細(xì)胞間傳遞信息，從而在血管生成過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。本文就 EVs 對(duì)血管生成影響的研究進(jìn)展綜述如下。

1 胞外囊泡的產(chǎn)生和生物學(xué)特性

EVs 是指在正常和應(yīng)激狀態(tài)下由不同細(xì)胞產(chǎn)生的脂質(zhì)雙分子層包繞的球囊狀結(jié)構(gòu)[1]。根據(jù)其大小和生成途徑，EVs 可分為 3 種主要類(lèi)型：外泌體、微泡和凋亡小體。外泌體的直徑在 30 ~ 120 nm 之間，微泡直徑在 100 ~ 1000 nm 之間，凋亡小體直徑在 800 ~ 5000 nm 之間。外泌體是由細(xì)胞膜與胞體內(nèi)陷形成的多泡體融合釋放而成，微泡則直接由細(xì)胞膜出芽生成，凋亡小體是由 caspase 介導(dǎo)的程序性死亡細(xì)胞出泡形成的[2]。研究發(fā)現(xiàn)，某些特異蛋白在 EVs 的生成和釋放中發(fā)揮重要的作用，如四跨膜蛋白家族分子（CD81、CD9 和 CD63）、熱休克蛋白（heat shock proteins，HSP90）、轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)體分選復(fù)合物（Tsg101、Alix）、參與膜融合的蛋白質(zhì)（Rabs、ARF6）和信號(hào)蛋白等[3-4]。此外，這些過(guò)去被認(rèn)為是外泌體特異性的蛋白也可以在微泡中被檢測(cè)出。所有 EVs 亞群體中的蛋白質(zhì)分布不均勻[5-6]。不同的細(xì)胞產(chǎn)生的 EVs 往往帶有其細(xì)胞膜上的特異性受體。而 EVs 膜脂質(zhì)組成及分布與母細(xì)胞不相同[3]。EVs 的質(zhì)膜富含磷脂酰絲氨酸、糖鞘脂、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺和膽固醇。而在 EVs 上表達(dá)的磷脂酰絲氨酸是其特征之一。除表面分子外，EVs 中還含有可溶性因子，如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)錄因子[3]。除了蛋白質(zhì)和脂類(lèi)，EVs 還可以整合遺傳物質(zhì)，例如小而長(zhǎng)的編碼和非編碼的 RNA（mRNA、miRNA 和 IncRNA），以及其他細(xì)胞質(zhì)成分和分子。

2 EVs 與血管生成

血管生成是指在已經(jīng)存在的血管網(wǎng)絡(luò)中形成新的血管的過(guò)程，存在于有機(jī)體的生長(zhǎng)和發(fā)育中。血管生成有以下兩種方式：一種是出芽式血管生成，經(jīng)過(guò)血管基底膜降解，內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）的增殖、遷移、發(fā)芽、分枝，形成新血管；另一種是套疊式血管生成，通過(guò)間質(zhì)組織侵入現(xiàn)有血管，形成跨血管組織柱，隨后血管擴(kuò)張和分裂形成新血管。新血管結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和成熟需要周細(xì)胞的聚集、細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和剪切應(yīng)力的機(jī)械刺激[2]。在健康的組織中，血管生成被促血管生成信號(hào)和抗血管生成信號(hào)精確平衡地調(diào)控。當(dāng)這種平衡受到干擾時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)血管生成異常，這是許多疾病進(jìn)展的主要原因，如癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、角膜新生血管、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和缺血性疾病等。因此，EVs 在血管形成過(guò)程中發(fā)揮重要的作用（表 1）。

2.1 EVs 促血管生成的作用機(jī)制

EVs 可通過(guò)向 ECs 傳遞促血管生成的 miRNA 發(fā)揮促血管生成作用。ECs 源性的外泌體中的 miR-214通過(guò)抑制其他內(nèi)皮細(xì)胞 ATM 的表達(dá)，在體外和體內(nèi)發(fā)揮促血管生成作用[7]。經(jīng)過(guò) IL-3 刺激的 EC 產(chǎn)生的 EVs 通過(guò)將 miR-126-3p 轉(zhuǎn)移到受體 EC，導(dǎo)致 Spred-1 降低，ERK1/2 激活，從而促進(jìn)血管生成[8]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡小體中的 miR-126 可以通過(guò)誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠靶細(xì)胞中 CXCL 12 的表達(dá)和內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPC）的募集發(fā)揮促血管生成的作用，并增加斑塊穩(wěn)定性而產(chǎn)生抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[9]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞（endothelial colony-forming cells，ECFC）的EVs 還可以預(yù)防大鼠腎缺血再灌注損傷后毛細(xì)血管稀疏和組織損傷。去除 EVs 中的 miR-126 和 miR-296 腎臟保護(hù)作用消失，說(shuō)明 miR-126 和 miR-296 血管生成中起關(guān)鍵作用[10]。脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）通過(guò)外泌體將 miR-125a 轉(zhuǎn)運(yùn)至 EC，抑制 DLL4 表達(dá)，增加頂細(xì)胞的形成，在體內(nèi)外發(fā)揮促血管生成的作用[11]。此外，用內(nèi)皮分化培養(yǎng)基對(duì)脂肪源性 MSCs 預(yù)處理可使微泡生成增加，這些微泡通過(guò)傳遞 miR-31 和抑制低氧誘導(dǎo)因子-1α 的抑制因子表達(dá)，增強(qiáng)促血管生成的作用[12]。小鼠骨髓來(lái)源的 MSC 經(jīng)過(guò)腦缺血組織提取物處理后產(chǎn)生的 EVs 富含 miR-210，miR-210 被轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)皮細(xì)胞中抑制 EFNA3 基因的表達(dá)，促進(jìn)血管生成[13]。同時(shí)，人臍帶源性 MSC 產(chǎn)生的外泌體通過(guò)激活 Wnt 4/β-catenin 通路發(fā)揮促血管生成作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞源性的微泡可以通過(guò)將 miR-150 轉(zhuǎn)運(yùn)到 EC 發(fā)揮促血管生成的作用[15]。

表 1 EVs 調(diào)控血管生成的主要機(jī)制

EVs 可以通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)某些蛋白質(zhì)發(fā)揮促血管生成的作用。通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的培養(yǎng)條件，可以大大提高 EVs 的血管生成潛能。研究發(fā)現(xiàn)用血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）處理脂肪源性 MSCs 產(chǎn)生的 EVs 中c-kit、干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）和基質(zhì)金屬蛋白酶含量的增加，從而增強(qiáng)其促血管生成作用。低氧處理臍帶源性 MSCs 產(chǎn)生的 EVs 富含 VEGF，從而增加促血管生成的作用。單側(cè)腎缺血大鼠經(jīng)靜脈注射這種 EVs，增加了缺血腎臟的毛細(xì)血管密度，從而發(fā)揮保護(hù)腎功能的作用[16]。血小板產(chǎn)生的微泡能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖、管狀結(jié)構(gòu)的形成，同時(shí)增強(qiáng)損傷后內(nèi)皮再生的能力。研究發(fā)現(xiàn)，用從動(dòng)脈粥樣硬化患者外周血中分離的血小板源性微泡處理循環(huán)血管生成細(xì)胞，可使大鼠缺血的后肢新生血管增多[17]。這種促血管生成作用與血小板源性微泡釋放的受激活調(diào)節(jié)正常 T 細(xì)胞表達(dá)和分泌因子有關(guān)。在主動(dòng)脈環(huán)模型鼠中，血小板源性微泡通過(guò)傳遞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2）和 PDGF 以及激活 PI3 激酶、src 激酶和 ERK 通路，以劑量依賴(lài)性的方式發(fā)揮促血管生成作用[18]。同時(shí)，在慢性心肌缺血的大鼠模型中，靜脈注射血小板微泡可增加心肌功能和毛細(xì)血管的數(shù)量，保護(hù)心功能。此外，C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）具有促血管生成的作用。2012 年澳大利亞學(xué)者在急性心肌梗死的患者血液標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)微泡可以轉(zhuǎn)運(yùn)單體 CRP 至ECs 并活化 ECs[19]。近期研究發(fā)現(xiàn)，攜帶音猬因子（sonic hedgehog，SHH）的微泡通過(guò)抑制 NO 的產(chǎn)生和減少氧化應(yīng)激，改善了血管緊張素 II 誘導(dǎo)的高血壓和主動(dòng)脈內(nèi)皮功能[20]。

EVs 也可以通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)一些轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮促血管生成的作用，如 pSTAT 3 和 pSTAT 5。研究發(fā)現(xiàn)，在缺血狀態(tài)下，骨髓源性 MSCs 的外泌體通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn) pSTAT 3 及激活 NF-κB 通路發(fā)揮促血管生成的作用[21-22]。而 IL-3 處理的ECs 產(chǎn)生的 EVs 通過(guò)將 pSTAT 5轉(zhuǎn)運(yùn)到 EC，增加 cyclinD1 翻譯，從而促血管生成[8]。

2.2 EVs 抗血管生成的作用機(jī)制

EVs 的抗血管生成作用在視網(wǎng)膜病變和腫瘤血管生成等病理性血管生成方面具有重要的治療作用。EVs 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞的 CD36 和 EVs 磷脂酰絲氨酸結(jié)合，激活 Fyn 激酶和 NADPH 氧化酶，產(chǎn)生活性氧，抑制 ECs 遷移和管腔形成[23]。研究發(fā)現(xiàn)，T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的微泡對(duì)血管生成的抑制作用是由低密度脂蛋白受體介導(dǎo)的，將靶 ECs 和腫瘤細(xì)胞中的低密度脂蛋白受體敲除，導(dǎo)致微泡攝取減少，導(dǎo)致 T 淋巴細(xì)胞微泡抗血管生成作用消失[24]。

3 EVs 治療血管生成的前景

在各種研究的基礎(chǔ)上，EVs 已經(jīng)成為細(xì)胞間通訊的主要形式，在血管生成中起著重要的作用。EVs 廣泛參與了血管生成、生長(zhǎng)和成熟。自 21 世紀(jì)初以來(lái)，EVs 已在黑色素瘤[25]、非小細(xì)胞肺癌[26-27]、結(jié)直腸癌[28]、I 型糖尿?。∟ct 02138331）患者中進(jìn)行了臨床試驗(yàn)。雖然參與研究的患者數(shù)量不多，但這些臨床試驗(yàn)證明了 EVs 在人體內(nèi)應(yīng)用的可行性和安全性。最近，一項(xiàng)前瞻性的臨床試驗(yàn)被啟動(dòng)，評(píng)價(jià)自體血漿來(lái)源的外泌體對(duì)頑固性皮膚潰瘍（Nct 02565264）患者傷口愈合的影響。這項(xiàng)臨床試驗(yàn)將提供關(guān)于 EVs 干預(yù)血管生成的可行性和有效性的重要信息。

4 問(wèn)題與展望

EVs 領(lǐng)域的研究發(fā)展迅速，現(xiàn)在已經(jīng)成為了研究熱點(diǎn)，尤其在癌癥、卒中等疾病中研究廣泛。EVs 不僅可以通過(guò)自身發(fā)揮作用，還可以通過(guò)運(yùn)輸藥物發(fā)揮作用，甚至用于一些基因治療。由此可見(jiàn) EVs 是極具前景的領(lǐng)域。越來(lái)越多的研究證實(shí)了 EVs 通過(guò)調(diào)節(jié) ECs 參與血管生成。與其他調(diào)節(jié)腫瘤、腦卒中、動(dòng)脈粥樣硬化、損傷后修復(fù)等疾病中的血管生成的方法相比，EVs 治療具有靶向性、無(wú)免疫原性、無(wú)致瘤性、安全性、儲(chǔ)存和運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)。EVs 將有希望成為干預(yù)血管生成的新手段，但 EVs 研究仍面臨著許多挑戰(zhàn)。其中關(guān)于 EVs 的應(yīng)用濃度仍然存在很大爭(zhēng)議。研究發(fā)現(xiàn)，EVs 對(duì)血管生成的影響是與劑量相關(guān)的。而現(xiàn)有研究 EVs 的量化方法不同，所以 EVs 發(fā)揮調(diào)節(jié)血管生成而又無(wú)副作用的濃度無(wú)法確定。不同的分離和提純 EVs 的方法也影響其完整性及功能。此外，EVs 的細(xì)胞來(lái)源和給藥途徑是其組織分布的關(guān)鍵決定因素。因此，在正常和病理?xiàng)l件下建立 EVs 的最佳給藥途徑、產(chǎn)生條件、統(tǒng)一分離提純及量化方法有助于提高其治療效果。

[1] Raposo G, Stoorvogel W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol, 2013, 200(4):373-383.

[2] Todorova D, Simoncini S, Lacroix R, et al. Extracellular vesicles in angiogenesis. Circ Res, 2017, 120(10):1658-1673.

[3] Yá?ez-Mó M, Siljander PR, Andreu Z, et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles, 2015, 4:27066.

[4] Colombo M, Raposo G, Théry C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol, 2014, 30:255-289.

[5] Colombo M, Moita C, van Niel G, et al. Analysis of ESCRT functions in exosome biogenesis, composition and secretion highlights the heterogeneity of extracellular vesicles. J Cell Sci, 2013, 126(Pt 24): 5553-5565.

[6] Urbanelli L, Buratta S, Sagini K, et al. Exosome-based strategies for diagnosis and therapy. Recent Pat CNS Drug Discov, 2015, 10(1): 10-27.

[7] van Balkom BW, de Jong OG, Smits M, et al. Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells. Blood, 2013, 121(19):3997-4006, S1-S15.

[8] Lombardo G, Dentelli P, Togliatto G, et al. Activated stat5 trafficking via endothelial cell-derived extracellular vesicles controls IL-3 pro-angiogenic paracrine action. Sci Rep, 2016, 6:25689.

[9] Zernecke A, Bidzhekov K, Noels H, et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci Signal, 2009, 2(100):ra81.

[10] Cantaluppi V, Gatti S, Medica D, et al. Microvesicles derived from endothelial progenitor cells protect the kidney from ischemia-reperfusion injury by microRNA-dependent reprogramming of resident renal cells. Kidney Int, 2012, 82(4):412-427.

[11] Liang X, Zhang L, Wang S, et al. Exosomes secreted by mesenchymal stem cells promote endothelial cell angiogenesis by transferring miR-125a. J Cell Sci, 2016, 129(11):2182-2189.

[12] Kang T, Jones TM, Naddell C, et al. Adipose-derived stem cells Induce angiogenesis via microvesicle transport of miRNA-31. Stem Cells Transl Med, 2016, 5(4):440-450.

[13] Moon GJ, Sung JH, Kim DH, et al. Application of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles for stroke: biodistribution and microRNA study. Transl Stroke Res, 2018. [Epub ahead of print]

[14] Zhang B, Wu X, Zhang X, et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes enhance angiogenesis through the Wnt4/beta- catenin pathway. Stem Cells Transl Med, 2015, 4(5):513-522.

[15] Li J, Zhang Y, Liu Y, et al. Microvesicle-mediated transfer of microRNA-150 from monocytes to endothelial cells promotes angiogenesis. J Biol Chem, 2013, 288(32):23586-23596.

[16] Zou X, Gu D, Xing X, et al. Human mesenchymal stromal cell-derived extracellular vesicles alleviate renal ischemic reperfusion injury and enhance angiogenesis in rats. Am J Transl Res, 2016, 8(10):4289-4299.

[17] Ohtsuka M, Sasaki K, Ueno T, et al. Platelet-derived microparticles augment the adhesion and neovascularization capacities of circulating angiogenic cells obtained from atherosclerotic patients. Atherosclerosis, 2013, 227(2):275-282.

[18] Brill A, Dashevsky O, Rivo J, et al. Platelet-derived microparticles induce angiogenesis and stimulate post-ischemic revascularization. Cardiovasc Res, 2005, 67(1):30-38.

[19] Habersberger J, Strang F, Scheichl A, et al. Circulating microparticles generate and transport monomeric C-reactive protein in patients with myocardial infarction. Cardiovasc Res, 2012, 96(1):64-72.

[20] Marrachelli VG, Mastronardi ML, Sarr M, et al. Sonic hedgehog carried by microparticles corrects angiotensin II-induced hypertension and endothelial dysfunction in mice. PLoS One, 2013, 8(8):e72861.

[21] Anderson JD, Johansson HJ, Graham CS, et al. Comprehensive proteomic analysis of mesenchymal stem cell exosomes reveals modulation of angiogenesis via nuclear factor-kappaB signaling. Stem Cells, 2016, 34(3):601-613.

[22] Shabbir A, Cox A, Rodriguez-Menocal L, et al. Mesenchymal stem cell exosomes induce proliferation and migration of normal and chronic wound fibroblasts, and enhance angiogenesis in vitro. Stem Cells Dev, 2015, 24(14):1635-1647.

[23] Ramakrishnan DP, Hajj-Ali RA, Chen Y, et al. Extracellular vesicles activate a CD36-dependent signaling pathway to inhibit microvascular endothelial cell migration and tube formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2016, 36(3):534-544.

[24] Yang C, Xiong W, Qiu Q, et al. Role of receptor-mediated endocytosis in the antiangiogenic effects of human T lymphoblastic cell-derived microparticles. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2012, 302(8):R941-R949.

[25] Escudier B, Dorval T, Chaput N, et al. Vaccination of metastatic melanoma patients with autologous dendritic cell (DC) derived-exosomes: results of thefirst phase I clinical trial. J Transl Med, 2005, 3(1):10.

[26] Morse MA, Garst J, Osada T, et al. A phase I study of dexosome immunotherapy in patients with advanced non-small cell lung cancer. J Transl Med, 2005, 3(1):9.

[27] Besse B, Charrier M, Lapierre V, et al. Dendritic cell-derived exosomes as maintenance immunotherapy after first line chemotherapy in NSCLC. Oncoimmunology, 2016, 5(4):e1071008.

[28] Dai S, Wei D, Wu Z, et al. Phase I clinical trial of autologous ascites-derived exosomes combined with GM-CSF for colorectal cancer. Mol Ther, 2008, 16(4):782-790.

國(guó)家自然科學(xué)基金（81371709）

田野，Email：yetian6@163.com

2018-12-06

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.02.011