孫彬裕，曲守方，于婷，孫楠，孫晶，胡澤斌，黃杰

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甲胎蛋白免疫測定用國家標(biāo)準(zhǔn)品的建立

孫彬裕*，曲守方*，于婷，孫楠，孫晶，胡澤斌，黃杰

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所

甲胎蛋白（AFP）是一種血清糖基化蛋白，在正常成人血清中含量極少。AFP 主要由胎兒卵黃囊和肝臟產(chǎn)生，其次是胃腸道黏膜、腎臟也可少量合成。AFP 是單鏈糖蛋白，分子量 65 ~ 70 kD，其物理化學(xué)特性和氨基酸組成類似于血清白蛋白，但抗原性不同[1-3]。作為一種腫瘤標(biāo)記物，AFP 可以用于腫瘤的診斷療效監(jiān)控，70% ~ 95% 的原發(fā)性肝癌患者呈現(xiàn) AFP 水平升高，AFP 異常升高提示原發(fā)性肝癌的發(fā)生[4-7]。妊娠期可通過 AFP 監(jiān)測進(jìn)行疾病的篩查和診斷，產(chǎn)前普查羊水中 AFP 水平可監(jiān)控胎兒異常，孕婦血清異常升高提示胎兒神經(jīng)管缺陷畸形，如脊柱裂、無腦兒、腦積水等，AFP 降低提示未出生的嬰兒有唐氏綜合征的危險性[8-11]。

目前國內(nèi)外有 70 多家具有注冊證的 AFP 測定試劑盒應(yīng)用于臨床，檢測方法包括化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法和時間分辨免疫熒光法等。但各家試劑盒產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，使用的抗體不同，使其對同一份標(biāo)本測定的同一腫瘤標(biāo)記的結(jié)果可能會有所差異，導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)室的測定結(jié)果不具有可比性[12]。為了解決這一問題，AFP 檢測的標(biāo)準(zhǔn)化極為重要。臨床實(shí)驗(yàn)室測定的標(biāo)準(zhǔn)化關(guān)鍵在于測定結(jié)果的量值溯源。實(shí)現(xiàn)量值溯源，一般可通過參考方法（或參考測量程序）和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來進(jìn)行，AFP 沒有參考方法，但有國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[13-14]。而研制 AFP 國家標(biāo)準(zhǔn)品，能夠規(guī)范我國 AFP 測定試劑盒的質(zhì)量，促進(jìn)我國 AFP 檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化。本實(shí)驗(yàn)室開展了 AFP 國家標(biāo)準(zhǔn)品的研制，并進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 AutoLumo A2000 Plus 全自動化學(xué)發(fā)光測定儀由鄭州安圖生物工程股份有限公司提供；Maglumi 2000 Plus 全自動化學(xué)發(fā)光測定儀由深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司提供；卓越 C1800 全自動化學(xué)發(fā)光測定儀由上?？迫A生物工程股份有限公司提供；iMark Bio-Rad 酶標(biāo)儀由艾康生物技術(shù)（杭州）有限公司提供；DR6608 時間分辨熒光免疫分析儀由廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司提供；Advia Centaur XPT 和 Immulite 2000 全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀由西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品（上海）有限公司提供；Access 2 全自動免疫分析儀由貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司提供；Cobas e411 電化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析儀由羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司提供；Liaison XL 全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀由索靈診斷醫(yī)療設(shè)備（上海）有限公司提供；HISCL-5000 全自動免疫分析儀由希森美康醫(yī)用電子（上海）有限公司提供。

1.1.2 試劑盒 甲胎蛋白定量檢測試劑盒（磁微粒化學(xué)發(fā)光法）為鄭州安圖生物工程股份有限公司產(chǎn)品；甲胎蛋白測定試劑盒（化學(xué)發(fā)光免疫分析法）為深圳新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司產(chǎn)品；甲胎蛋白定量測定試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）為上?？迫A生物工程股份有限公司產(chǎn)品；甲胎蛋白檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）為艾康生物技術(shù)（杭州）有限公司產(chǎn)品；甲胎蛋白定量測定試劑盒（時間分辨免疫熒光法）為廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；甲胎蛋白測定試劑盒（直接化學(xué)發(fā)光法）和甲胎蛋白測定試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）為西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品（上海）有限公司產(chǎn)品；甲胎蛋白測定試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）為貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司產(chǎn)品；甲胎蛋白檢測試劑盒（電化學(xué)發(fā)光法）為羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司產(chǎn)品；甲胎蛋白檢測試劑盒（化學(xué)發(fā)光免疫分析法）為索靈診斷醫(yī)療設(shè)備（上海）有限公司產(chǎn)品；甲胎蛋白檢測試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）為希森美康醫(yī)用電子（上海）有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)品 AFP 國際標(biāo)準(zhǔn)品（Alpha fetoprotein, Human, NIBSC code: AFP，100 000 IU/支）由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 方法

1.2.1 AFP 國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品制備 精確量取來源于臍帶血提取的甲胎蛋白原料，加至賦形劑（去激素血清）內(nèi)，充分混勻后，配制成理論濃度約為 900 IU/ml 的 AFP 國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品溶液，置于 2 ~ 8℃過夜，次日經(jīng) 0.22 μm 濾膜無菌過濾，每支安瓿 0.5 ml 進(jìn)行分裝，凍干制備成 AFP 國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品。

1.2.2 AFP 國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品瓶間精密度實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)抽取 10 支候選品，使用鄭州安圖生物工程股份有限公司甲胎蛋白定量檢測試劑盒（磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法），平行進(jìn)行分析測定，計算其效價比的變異系數(shù)（CV%）。

1.2.3 AFP 國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 每次隨機(jī)選取候選品 2 支，37 ℃放置 1 ~ 12 周后，以–20 ℃保存的 AFP 國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品（記為 0 周）為對照，使用鄭州安圖生物工程股份有限公司甲胎蛋白定量檢測試劑盒，對穩(wěn)定性候選品樣本平行進(jìn)行分析測定，計算其效價比。

1.2.4 AFP 國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品協(xié)作標(biāo)定 在各廠家試劑盒反應(yīng)體系的線性范圍內(nèi)，以 AFP 國際標(biāo)準(zhǔn)品為對照，對候選品（隨機(jī)抽?。┻M(jìn)行協(xié)作標(biāo)定實(shí)驗(yàn)。按各試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)處理采用 Log-log 雙對數(shù)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析。

1.2.5 AFP 國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品一致性研究 收集 20 ~40 份新鮮的臨床 AFP 血清樣本，肉眼無溶血、脂血和黃疸，濃度范圍包含標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度且呈現(xiàn)一定的濃度梯度，每個濃度收集 2 ~ 8 ml，500 μl 或 1 ml 分裝，–20 ℃以下保存。配制不同濃度的 AFP 國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品和國際標(biāo)準(zhǔn)品，然后使用鄭州安圖生物工程股份有限公司甲胎蛋白定量檢測試劑盒，同時測定 AFP 國際標(biāo)準(zhǔn)品、國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品以及上述的血清樣本。每個樣品的測量結(jié)果為該測量系統(tǒng)的測量結(jié)果。分別以 AFP 國際標(biāo)準(zhǔn)品和國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品為標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析血清樣本測定的結(jié)果，評價 AFP 國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品與 AFP 國際標(biāo)準(zhǔn)品的一致性。

2 結(jié)果

2.1 AFP 國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品瓶間精密度實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)抽取 10 支候選品，使用鄭州安圖生物工程股份有限公司甲胎蛋白定量檢測試劑盒平行進(jìn)行分析測定，AFP 國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品 1 ~ 10 瓶間精密度的結(jié)果：效價比均值為 1.0283，標(biāo)準(zhǔn)差為 0.014，變異系數(shù)為 1.4%（表 1）。結(jié)果表明，AFP 國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品的瓶間一致性好。

2.2 AFP 國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

37 ℃放置1 ~ 12 周后，與–20 ℃保存的標(biāo)準(zhǔn)品候選品（作為 0 周）效價比在 0.91 ~ 1.03 之間（表 2）。結(jié)果表明，AFP 國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品非常穩(wěn)定。

2.3 AFP 國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品協(xié)作標(biāo)定

AFP 國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品的免疫活性理論值為 900 IU/支。本次協(xié)作研究中，以 AFP 國際標(biāo)準(zhǔn)品為對照品，在各檢測系統(tǒng)上測定候選品，用 Log-log 數(shù)學(xué)模型擬合，要求 AFP 國際標(biāo)準(zhǔn)品與候選品的劑量-反應(yīng)曲線均不顯著偏離平行（檢驗(yàn)），并對各試劑盒的標(biāo)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析和匯總。若檢驗(yàn)結(jié)果> 0.05，表明候選品與國際標(biāo)準(zhǔn)品的劑量-反應(yīng)曲線平行，候選品與 AFP 國際標(biāo)準(zhǔn)品同質(zhì)。根據(jù) 10 個廠家 11 種試劑盒協(xié)作標(biāo)定結(jié)果，最終確定 AFP 國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品的免疫活性為 930 IU/安瓿（表 3）。

表 1 瓶間精密度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

表 2 熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

表 3 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果

2.4 AFP 國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品一致性研究

在檢測系統(tǒng)上同時測定 AFP 國際標(biāo)準(zhǔn)品、國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品以及 40 份臨床 AFP 血清樣本。分別以 AFP 國際標(biāo)準(zhǔn)品和國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品為標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析臨床 AFP 血清樣本測定的結(jié)果。以臨床樣本測定結(jié)果做散點(diǎn)圖，Y 軸為以 AFP 國際標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的結(jié)果，X 軸為以 AFP 國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品為標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的結(jié)果，進(jìn)行線性相關(guān)性分析，線性相關(guān)系數(shù)為 0.9991（圖 1）。研究結(jié)果表明，AFP 國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品與 AFP 國際標(biāo)準(zhǔn)品的一致性很好。

圖 1 一致性結(jié)果

3 討論

AFP 測定試劑盒在臨床上主要用于原發(fā)性肝癌的高危人群的篩查、輔助診斷、療效和治療及復(fù)發(fā)監(jiān)測等。制定統(tǒng)一的國家標(biāo)準(zhǔn)品有助于使各實(shí)驗(yàn)室間的檢測結(jié)果具有可比性，實(shí)現(xiàn)檢測標(biāo)準(zhǔn)化。本次協(xié)作標(biāo)定中選用的 AFP 測定試劑盒涉及化學(xué)發(fā)光、酶聯(lián)免疫法和時間分辨免疫熒光法，涵蓋了我國市場上的主要產(chǎn)品。本次研究以 AFP 國際標(biāo)準(zhǔn)品為對照品，將 AFP 國際標(biāo)準(zhǔn)品與國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果表明國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品與國際標(biāo)準(zhǔn)品的劑量-反應(yīng)曲線平行，國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品與 AFP 國際標(biāo)準(zhǔn)品同質(zhì)，可實(shí)現(xiàn)量值傳遞的追溯性和連續(xù)性。

通過對國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品的瓶間精密度、熱穩(wěn)定性和一致性研究，此批 AFP 國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品能滿足作為 AFP 國家標(biāo)準(zhǔn)品的要求，可用于 AFP 免疫分析及相應(yīng)試劑盒的性能評價。

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*同為第一作者

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.02.015

黃杰，Email：jhuang5522@126.com；胡澤斌，Email：huzbcmba@163.com

2019-01-14