鄭蕊，杰永生，陳磊，靳少鋒，綦惠，孫磊，舒雄

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脫細(xì)胞真皮基質(zhì)/生物礦化膠原一體化骨軟骨支架的制備及其生物相容性的研究

鄭蕊，杰永生，陳磊，靳少鋒，綦惠，孫磊，舒雄

100035，北京積水潭醫(yī)院/北京市創(chuàng)傷骨科研究所骨庫(kù)

成功制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)/生物礦化膠原一體化骨軟骨支架，并進(jìn)行理化性質(zhì)、生物力學(xué)與生物相容性評(píng)估，為骨軟骨缺損修復(fù)提供理論依據(jù)。

以物理和化學(xué)方法制備牛源脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，利用磷酸三鈣和膠原，按照不同比例混合，利用自組裝和凍干技術(shù)，制備以脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架為軟骨層，生物礦化膠原為骨層的骨軟骨一體化雙相支架。通過(guò)大體觀察、掃描電鏡觀察、生物力學(xué)等檢測(cè)，對(duì)骨軟骨一體化支架進(jìn)行理化性質(zhì)和力學(xué)性能評(píng)價(jià)。原代培養(yǎng)小鼠軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，并分別種植在脫細(xì)胞真皮基質(zhì)和生物礦化膠原雙相支架上，利用細(xì)胞毒、死/活細(xì)胞染色和增殖實(shí)驗(yàn)等觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，測(cè)定骨軟骨一體化支架的生物相容性。

大體觀察表明支架各層間結(jié)合緊密，未出現(xiàn)明顯不連續(xù)和相互分離。掃描電鏡各層內(nèi)的孔隙結(jié)構(gòu)相互連通且均具有立體多維性，其中脫細(xì)胞真皮基質(zhì)、生物礦化膠原和雙相支架的孔徑分別為（121.6 ± 8.65）、（98.40 ± 5.56）和（103.2 ± 3.94）μm。同時(shí)三組支架的壓縮模量分別為（41.05 ± 11.69）、（108.0 ± 12.71）和（84.98 ± 8.51）kPa，彈性模量分別為（17.24 ± 3.93）、（28.98 ± 3.31）和（21.74 ±2.92）kPa。MTT 法表明骨軟骨一體化支架無(wú)細(xì)胞毒性。熒光顯微鏡觀察顯示，縱切的支架薄片上細(xì)胞生長(zhǎng)分布均勻，表明支架生物相容性較好，CCK8 實(shí)驗(yàn)表明支架可以維持良好的細(xì)胞活性。

脫細(xì)胞真皮基質(zhì)/生物礦化膠原骨雙相支架中上下層間的理化性能展示了骨軟骨組織結(jié)構(gòu)和力學(xué)方面的雙重仿生，為動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)，有望成為治療骨軟骨缺損修復(fù)的一種新手段。

脫細(xì)胞真皮基質(zhì)； 生物礦化膠原； 雙相支架； 骨軟骨

關(guān)節(jié)軟骨病變是一種常見(jiàn)臨床疾病，主要是由創(chuàng)傷炎癥、創(chuàng)傷及關(guān)節(jié)活動(dòng)壓力造成軟骨的退化和病變，最終導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[1-2]。由于關(guān)節(jié)軟骨缺少血管、神經(jīng)及未分化細(xì)胞，因而自身修復(fù)能力有限。目前臨床上采用的技術(shù)主要有：微骨折術(shù)、自體/異體軟骨移植、自體/異體軟骨細(xì)胞移植等[3-6]。但目前這些治療方法具有相應(yīng)的缺點(diǎn)，如形成纖維軟骨，承重區(qū)修復(fù)效果不明顯且易于復(fù)發(fā)等。同時(shí)供區(qū)有限，大塊軟骨缺損難以應(yīng)用，易造成疾病傳播和免疫排斥反應(yīng)等一系列問(wèn)題，制約傳統(tǒng)治療方法對(duì)骨軟骨缺損修復(fù)的進(jìn)展。

近年來(lái)，組織工程為臨床治療軟骨損傷提供了新的思路[7-8]，其中組織工程支架是非常重要的組成部分，所以選擇合適的骨軟骨支架材料至關(guān)重要?？紤]骨軟骨層不同結(jié)構(gòu)的理化性質(zhì)、生物化學(xué)和生物力學(xué)特性，最佳的策略是設(shè)計(jì)骨軟骨一體化雙層支架，滿足骨和軟骨再生不同需求。此外，能保持不同組分相鄰但物理分開(kāi)，而且可以防止骨軟骨脫層發(fā)生。目前已應(yīng)用于骨軟骨一體化支架的材料包括多種天然的、合成的高分子材料[9-11]，如固體多孔支架或纖維支架、水凝膠等，以我們前期研究成果為基礎(chǔ)[12]，采用脫細(xì)胞技術(shù)去除小牛真皮的細(xì)胞抗原和細(xì)胞核物質(zhì)，但保留其天然細(xì)胞外基質(zhì)成分和生物活性物質(zhì)，脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（acellular dermal matrix，ADM）可以提供細(xì)胞生長(zhǎng)的天然微環(huán)境，具有良好的細(xì)胞及生物相容性，是軟骨修復(fù)適合的支架材料。磷酸三鈣的孔徑孔隙率和機(jī)械強(qiáng)度與正常骨組織無(wú)顯著差異，是骨修復(fù)的理想材料。

本實(shí)驗(yàn)擬選用小牛 ADM、生物礦化膠原和磷酸三鈣原材料，以 ADM 作為支架上層，生物礦化膠原作支架下層，聯(lián)合運(yùn)用自組裝技術(shù)和冷凍干燥等技術(shù)，制備高度仿生性的骨軟骨結(jié)構(gòu)一體化雙相支架，并對(duì)其理化性能及生物相容性進(jìn)行檢測(cè)，為后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)，給組織工程修復(fù)骨軟骨缺損構(gòu)建一種具有一體化結(jié)構(gòu)的復(fù)合支架材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 新鮮的牛跟腱、新鮮牛皮、胃蛋白酶、胰酶、高糖 DMEM、低糖 DMEM 和胎牛血清（FBS）均購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；MTT、氯化鈉、磷酸三鈣、無(wú)水乙酸、甲醛、I 型膠原酶和 DAPI 染料購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；CCK8 試劑盒購(gòu)自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司。

1.1.2 儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱為美國(guó) Shellab 公司產(chǎn)品；SEM-6380LV 型掃描電鏡購(gòu)自日本電子株式會(huì)社；往復(fù)式真空泵為上海益化真空設(shè)備有限公司產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本 Olympus 公司；SHW200R 型勻漿機(jī)購(gòu)自上海盛海威電氣儀表有限公司；冷凍大容量離心機(jī)購(gòu)自湘儀離心機(jī)儀器有限公司；熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó) Leica 公司；Instron 5565 材料試驗(yàn)機(jī)購(gòu)自美國(guó) Instron 公司。

1.2 方法

1.2.1 生物礦化膠原制備 牛跟腱 5 g，剪碎，置于 0.5 mol/L 乙酸溶液中，并加入 2.5 g胃蛋白酶，勻漿機(jī)勻漿。4000 r/min 離心 30 min，取上清，加入 20% NaCl 500 ml。4000 r/min 離心 15 min，棄上清。取沉淀，約 100 ml，加入蒸餾水 400 ml，0.5 mol/L 乙酸 15 ml，置于透析袋，透析 4 d，每日換水。透析結(jié)束后，加入 0.5 mol/L 乙酸 10 ml，4 ℃保存，膠原和β-磷酸三鈣質(zhì)量比 3:7 通過(guò)勻漿機(jī)高速混勻，制備生物礦化膠原懸液。

1.2.2 小牛 ADM 的制備 ①脫細(xì)胞處理：取新生小牛背部皮膚，脫毛、清洗，乙酸溶液浸泡溶脹 2 h，使皮膚表皮、真皮和皮下組織各層有相對(duì)明顯的界線，電動(dòng)取皮刀切取厚度為 1 ~ 2 mm 的真皮層。流水沖洗乙酸后，室溫下用 0.5% SDS 溶液水平振蕩脫細(xì)胞 2 h，更換新的 SDS 溶液，再繼續(xù)作用 2 h，流水沖洗過(guò)夜。蒸餾水再次沖洗 20 次后，冷凍干燥機(jī)中凍干。②結(jié)構(gòu)重塑：脫細(xì)胞真皮基質(zhì)置于 0.5% 胰蛋白酶溶液，室溫超聲振蕩2.5 h，冷凍干燥機(jī)中凍干。③交聯(lián)：結(jié)構(gòu)重塑后，用甲醛作為交聯(lián)劑室溫浸泡 2 h。PBS 沖洗 3 次，流水沖洗過(guò)夜，以去除殘留的交聯(lián)劑，再用蒸餾水清洗 20 次后凍干，冷凍干燥，60Co 照射后備用。

1.2.3 一體化支架的制備 生物礦化膠原懸液作為一體化支架下層，ADM 作為一體化支架上層。首先將冷凍干燥 ADM 放入聚丙烯圓筒形模具中（內(nèi)徑5 mm；高5 mm），將制備的生物礦化膠原懸液經(jīng)脫氣后，緩慢注入模具中。為使接觸界面緊密，使懸液固化成型，即在–80 ℃冰箱內(nèi)維持2 h，冷凍樣品最終在冷凍干燥機(jī)內(nèi)真空條件下冷凍干燥 48 h，脫模后成功取出支架。另制備 ADM 單相支架和生物礦化膠原單相支架同期對(duì)照，最后將制作好的支架用 20 kGy60Co γ 射線輻照滅菌后，4 ℃條件下密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 支架的結(jié)構(gòu)特征觀察 ①取支架進(jìn)行大體觀察及 Micro-CT 觀察：通過(guò)Micro-CT 斷層掃描成像技術(shù)，分析骨軟骨一體化雙相支架每層孔隙率及孔徑大小。②掃描電鏡觀察：將骨軟骨一體化雙相支架的每層于水平面和垂直面切開(kāi)，并固定于鋁質(zhì)底座上，進(jìn)行離子濺射噴金，在加速電壓下進(jìn)行掃描電鏡觀察。③骨軟骨一體化支架溶脹率測(cè)定如下：冷凍干燥支架稱重稱為干重（Wd），然后在指定時(shí)間內(nèi)浸入 37 ℃的 PBS 緩沖液（pH = 7.4），分別取出支架稱重稱為濕重（Ws）（n = 3），支架溶脹率計(jì)算如下：（Ws – Wd）/ Wd × 100%。

1.2.5 力學(xué)測(cè)試 將凍干后三種支架制備直徑6 mm、高 6 mm 的圓柱體，支架樣本處于完全濕潤(rùn)狀態(tài)，支架在室溫下浸泡于去離子水至測(cè)試時(shí)取出。將樣本置于定制的上下兩層剛性?shī)A板之間，Instron 5565 材料試驗(yàn)機(jī)，最大應(yīng)變達(dá)總應(yīng)變的 20% 時(shí)停止。記錄相關(guān)測(cè)試數(shù)據(jù)自動(dòng)輸出，根據(jù)應(yīng)力-應(yīng)變曲線的線性變化部分，并計(jì)算相應(yīng)的壓縮模量。彈性模量檢測(cè)：將三種支架固定于 Instron 5565 材料試驗(yàn)機(jī)上下兩層夾板間，以 0.01 mm/s 的恒定拉伸速率進(jìn)行位移控制，以雙層界面各自分離為極限拉伸強(qiáng)度，最終測(cè)定其彈性模量。

1.2.6 細(xì)胞毒性檢測(cè) 支架浸提液制備：取支架根據(jù)表面積體積比，計(jì)算出所需的DMEM 培養(yǎng)液量。將計(jì)算好的 DMEM 培養(yǎng)液加入無(wú)菌裝有支架的離心管內(nèi)，在 37 ℃溫箱孵育 24 h 后，取上清液過(guò)濾，即為支架浸提液。實(shí)驗(yàn)組及 MTT 檢測(cè)方法：取 L929成纖維細(xì)胞培養(yǎng)使其貼壁與生長(zhǎng)，24 h 后胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)，每孔 100 μl，細(xì)胞濃度 4 × 107個(gè)/L 鋪板，分 2 組培養(yǎng)，每組 3 孔。將原培養(yǎng)液倒掉，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別加入骨軟骨一體化支架浸提液和正常 DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。培養(yǎng) 2、4 和 7 d 取 1 塊板，棄去培養(yǎng)液，每孔加入 20 μl MTT 液于無(wú)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；4 h 后每孔加入 150 μl DMSO，振蕩均勻后，于 492 nm 處測(cè)定吸光度（）值。

1.2.7 小鼠關(guān)節(jié)軟骨和成骨細(xì)胞 分別取新生小鼠膝關(guān)節(jié)和顱骨。然后，將樣品切成片，采用0.2 % II 型膠原酶和I 型膠原酶分別消化軟骨切片和顱骨切片。在完全消化后，分離細(xì)胞懸液過(guò)濾、離心。然后，將獲得軟骨和成骨細(xì)胞培養(yǎng)到 P3備用，用 PBS 對(duì) ADM 和生物礦化膠原支架進(jìn)行 3 次洗滌，分別接種軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。接種 12 h 后，將支架/細(xì)胞復(fù)合材料移入另一個(gè)空 24 孔板。在不同的時(shí)間間隔（1、4 和 7 d）用 CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞數(shù)增殖情況。

1.2.8 死/活細(xì)胞染色 將 P3代的小鼠軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分別種植到支架上，種植大約 8 ×106個(gè)細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞-支架復(fù)合體，37 ℃和 5% CO2培養(yǎng)箱孵育 3 d 和 7 d后，將其用刀片切成均勻薄片取出，在避光條件下進(jìn)行死/活細(xì)胞染色，無(wú)菌 PBS 溶液清洗 2 次，棄掉反應(yīng)后的液體，再次用 PBS 液清洗細(xì)胞-支架復(fù)合物薄片 2 次。加入 DAPI 孵育 5 min，PBS 清洗 2 次，然后進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 骨軟骨一體化支架的結(jié)構(gòu)特征

采用改良自組裝技術(shù)和冷凍干燥技術(shù)成功制備出新型的 ADM/生物礦化膠原一體化支架，該支架的界面區(qū)域均顯示出良好的連續(xù)性。界面處整合良好，未出現(xiàn)裂隙及分層現(xiàn)象（圖 1A 和 1B）。ADM 和生物礦化膠原各自的孔隙結(jié)構(gòu)是顯著不同的（圖 1C），ADM 內(nèi)呈縱向平行疏松的孔道（圖 1D），生物礦化膠原的結(jié)構(gòu)相對(duì)致密（圖 1E）。骨軟骨一體化支架的橫切面呈多孔網(wǎng)狀，內(nèi)部有良好的孔隙（圖 1F）。

2.2 骨軟骨一體化支架的理化特性

軟骨組織工程不僅需要一個(gè)相互連接的多孔支架結(jié)構(gòu)，也需要合理的孔徑及分布。Micro-CT 測(cè)定 ADM、生物礦化膠原和一體化雙相支架的結(jié)構(gòu)孔徑，ADM 孔徑和生物礦化膠原孔徑分別為（121.6 ± 8.65）μm 和（98.40 ± 5.56）μm，一體化雙相支架平均孔徑為（103.2 ± 3.94）μm，有利于細(xì)胞培養(yǎng)（圖 2A）。采用溶脹平衡測(cè)定法，三種支架凍干樣品吸收 PBS 緩沖液 30 min 內(nèi)逐漸達(dá)到溶脹平衡。在相同時(shí)間內(nèi)，ADM 溶脹率高于生物礦化膠原的溶脹率，結(jié)構(gòu)一體化支架的綜合溶脹率在兩者之間，骨軟骨一體化支架溶脹率的變化與對(duì)應(yīng)的支架多孔性一致。結(jié)果表明，較大的孔徑和較高的多孔性使得它有更多的儲(chǔ)水空間，導(dǎo)致吸水率增加（圖 2B）。

Figure 1 Morphological characterization of osteochondral integrated scaffold (A: The lateral gross morphology observation; B: The vertical gross morphology observation; C: The vertical section; D: The upper structure of scaffold; E: The lower structure of scaffold; F: The lateral section)

圖 2 骨軟骨一體化支架的物理化學(xué)特性（A：孔徑；B：溶脹率）

Figure 2 The physicochemical properties of osteochondral integrated scaffold (A: The pore sizes; B: Swelling abilities)

Figure 3 Viability, proliferation and attachment of cells on osteochondral integrated scaffold (A: Cell cytotoxicity detected by MTT assay; B: Cell proliferation on the ADM and biomineralized collagen measured; C: ADM determined by DAPI staining for 3 days;D: ADM determined by DAPI staining for 7 days; E: The biomineralized collagen determined by DAPI staining for 3 days; F: The biomineralized collagen determined by DAPI staining for 7 days)

2.3 骨軟骨一體化支架的生物力學(xué)性能測(cè)定

支架的力學(xué)性能是軟骨缺損修復(fù)的主要因素，其中植入缺陷區(qū)域的動(dòng)態(tài)加載起關(guān)鍵作用。力學(xué)測(cè)試結(jié)果表明 ADM、生物礦化膠原和雙層支架的壓縮模量分別為（41.05 ± 11.69）、（108.0 ±12.71）和（84.98 ± 8.51）kPa。骨軟骨一體化雙相支架層間結(jié)合緊密，其中 ADM 的彈性模量為（17.24 ± 3.93）kPa，生物礦化膠原的彈性模量則為（28.98 ± 3.31）kPa，雙層支架的彈性模量為（21.74 ± 2.92）kPa。

2.4 骨軟骨一體化支架的體外生物相容性檢測(cè)

MTT 檢測(cè)顯示，骨軟骨一體化支架和正常組均能促進(jìn) L929 細(xì)胞生長(zhǎng)，各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與正常組比較值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（> 0.05）（圖 3A），表明支架材料無(wú)細(xì)胞毒性。其次，軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分別種植 ADM 和生物礦化膠原支架上，CCK8 測(cè)定支架在不同時(shí)間間隔的細(xì)胞增殖情況。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，7 d 后軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞在上下層支架上與 1 d 相比，軟骨和成骨細(xì)胞增殖 3 倍左右且無(wú)明顯差異（圖 3B），這表明骨軟骨一體化支架有利于細(xì)胞存活。此外，分別在ADM 和生物礦化膠原上培養(yǎng)軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng) 3，7 d 后，ADM 和生物礦化膠原中細(xì)胞核用 DAPI 染色，熒光顯微鏡結(jié)果表明通過(guò) 3 d 和 7 d 培養(yǎng)，ADM 表面發(fā)現(xiàn)逐漸增多的紫色熒光的活細(xì)胞（圖 3C 和 3D），同時(shí)在生物礦化膠原表面也發(fā)現(xiàn)增多的紫色熒光的活細(xì)胞（圖 3E 和 F）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示骨軟骨一體化支架有良好的生物相容性。

3 討論

由于創(chuàng)傷、運(yùn)動(dòng)等原因造成的軟骨損傷最終導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎是骨科臨床的難點(diǎn)，骨軟骨組織工程給人們帶來(lái)了新的希望。因?yàn)楣擒浌窃诮馄式Y(jié)構(gòu)上緊密相連，單一的軟骨修復(fù)難以與骨界面整合，而骨軟骨復(fù)合支架將形成軟骨-骨連接面，這樣不僅加快了愈合速度，而且可以仿生其生物力學(xué)性能。因此，能夠固定和保持良好穩(wěn)定性的一體化組織工程支架成為軟骨組織工程研究焦點(diǎn)[13-14]。根據(jù)骨軟骨結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，課題組構(gòu)建脫細(xì)胞真皮基質(zhì)/生物礦化膠原一體化支架，真皮來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)來(lái)源于動(dòng)物皮膚組織，去除了皮膚表皮和真皮層中的細(xì)胞成分，而保留了真皮的膠原和基底膜成分。這種材料在組織工程中有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，不僅能起到支撐作用，同時(shí)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、移行及分化。除此之外，真皮來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)可以通過(guò)生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等來(lái)調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有良好的生物相容性[15]，有利于細(xì)胞的黏附與生長(zhǎng)。β-磷酸三鈣與人體骨骼無(wú)機(jī)成分相似，生物相容性好，易生物降解吸收，具有很好的力學(xué)性能和成骨誘導(dǎo)性，是骨軟骨一體化多相支架骨層重要組成部分[16]。另外，膠原蛋白具有良好組織相容性及具有較高的生物黏性，可以很好地將β-磷酸三鈣粉末連接固定在一起，通過(guò)逐層冷凍制備支架，可形成互相交錯(cuò)、滲透、緊密結(jié)合的結(jié)構(gòu)，有效防止骨軟骨雙相支架層與層之間出現(xiàn)脫離，實(shí)現(xiàn)交界面緊密無(wú)縫連接的一體化設(shè)計(jì)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)物理和化學(xué)的方法制備脫去真皮的細(xì)胞，充分保留了細(xì)胞外基質(zhì)中膠原與多糖等成分，其良好的生物學(xué)特性非常有利于種子細(xì)胞與周圍正常組織細(xì)胞的黏附與生長(zhǎng)。通過(guò)掃描電鏡觀察支架微觀結(jié)構(gòu)可見(jiàn)，軟骨層內(nèi)孔隙間連通性良好，同時(shí)骨層有較高的孔隙率與相對(duì)較大的孔徑，故其有利于組織內(nèi)細(xì)胞間氧氣與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖，表現(xiàn)出較好的力學(xué)性能。目前已證明 β-磷酸三鈣可增強(qiáng)一體化支架力學(xué)性能，也可提高來(lái)自 MSCs 成骨分化的能力。但是單純的β-磷酸三鈣不具備很好的可塑性，通過(guò)β-磷酸三鈣與膠原的不同質(zhì)量比混合，發(fā)現(xiàn)其質(zhì)量比為 7:3 時(shí)，冷凍干燥骨層支架的力學(xué)性能與吸水能力表現(xiàn)均衡。因此，本研究中一體化雙相支架制備過(guò)程中，ADM 層、β-磷酸三鈣與膠原逐層冷凍，結(jié)果顯示一體化支架各層間無(wú)明顯分層現(xiàn)象。此外，MTT 檢測(cè)、熒光染色和 CCK8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明骨軟骨一體化雙相支架有良好的細(xì)胞相容性。

本研究制備新型骨軟骨一體化雙相支架，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明其良好的生物相容性和力學(xué)特性，進(jìn)一步探究其修復(fù)關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的可行性。但本實(shí)驗(yàn)作為體外實(shí)驗(yàn)的前期研究，難以模擬動(dòng)物體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨復(fù)雜的動(dòng)態(tài)微環(huán)境[17]，對(duì)將該多相支架植入動(dòng)物體內(nèi)的修復(fù)再生表現(xiàn)尚不明確。因此，下一步研究應(yīng)將骨軟骨一體化雙相支架植入動(dòng)物體內(nèi)，觀察其對(duì)骨軟骨缺損的修復(fù)再生效果，為臨床轉(zhuǎn)化與應(yīng)用做進(jìn)一步努力。

[1] Ishijima M, Kaneko H, Okada Y, et al. Cartilage/chondrocyte research and osteoarthritis. Current concept and future perspective for diagnosis and treatment of osteoarthritis of the knee. Clin Calcium, 2018, 28(6):749-759.

[2] Huey DJ, Hu JC, Athanasiou KA. Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive. Science, 2012, 338(6109):917-927.

[3] Erggelet C, Vavken P. Microfracture for the treatment of cartilage defects in the knee joint-A golden standard? J Clin Orthop Trauma, 2016, 7(3):145-152.

[4] Emre TY, Atbasi Z, Demircioglu DT, et al. Autologous osteochondral transplantation (mosaicplasty) in articular cartilage defects of the patellofemoral joint: retrospective analysis of 33 cases. Musculoskelet Surg, 2017, 101(2):133-138.

[5] Schroeder JH, Hufeland M, Sch Tz M, et al. Injectable autologous chondrocyte transplantation for full thickness acetabular cartilage defects: early clinical results. Arch Orthop Trauma Surg, 2016, 136(10):1445-1451.

[6] de Windt TS, Vonk LA, Slaper-Cortenbach ICM, et al. Allogeneic MSCs and recycled autologous chondrons mixed in a one-stage cartilage cell transplantion: a first-in-man trial in 35 patients. Stem Cells, 2017, 35(8):1984-1993.

[7] Hung KC, Tseng CS, Dai LG, et al. Water-based polyurethane 3D printed scaffolds with controlled release function for customized cartilage tissue engineering. Biomaterials, 2016, 83:156-168.

[8] Gugjoo MB, Amarpal, Sharma GT, et al. Cartilage tissue engineering: Role of mesenchymal stem cells along with growth factors & scaffolds. Indian J Med Res, 2016, 144(3):339-347.

[9] Levingstone TJ, Matsiko A, Dickson GR, et al. A biomimetic multi-layered collagen-based scaffold for osteochondral repair. Acta Biomater, 2014, 10(5):1996-2004.

[10] Nonoyama T, Wada S, Kiyama R, et al. Double-network hydrogels strongly bondable to bones by spontaneous osteogenesis penetration. Adv Mater, 2016, 28(31):6740-6745.

[11] Choi B, Kim S, Lin B, et al. Cartilaginous extracellular matrix-modified chitosan hydrogels for cartilage tissue engineering. ACS Appl Mater Interfaces, 2014, 6(22):20110-20121.

[12] Shu X, Zheng R, Jie YS, et al. Effect of adipose-derived stem cells combine with acellular dermal matrix in repair of rabbit articular cartilage defects. Chin Med Biotechnol, 2017, 12(2):143-148. (in Chinese)

舒雄, 鄭蕊, 杰永生, 等. 脂肪干細(xì)胞復(fù)合真皮脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究. 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2017, 12(2):143-148.

[13] Qu D, Li J, Li Y, et al. Ectopic osteochondral formation of biomimetic porous PVA-n-HA/PA6 bilayered scaffold and BMSCs construct in rabbit. J Biomed Mater Res B Appl Biomater, 2011, 96(1):9-15.

[14] Panseri S, Russo A, Cunha C, et al. Osteochondral tissue engineering approaches for articular cartilage and subchondral bone regeneration. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc, 2012, 20(6):1182-1191.

[15] Ma A, Jiang L, Song L, et al. Reconstruction of cartilage with clonal mesenchymal stem cell-acellular dermal matrix in cartilage defect model in nonhuman primates. Int Immunopharmacol, 2013, 16(3):399-408.

[16] Zha G, Li X, Niu X, et al. Application of collagen-β-tricalcium phosphate complex for repairing articular cartilage defects. J Biomaterials Tissue Eng, 2017, 7(3):241-247.

[17] Wu JY, Chen H, Yang L. Current status of intra-articular injection of drugs and biological agents in the treatment of osteoarthritis. J Clin Orthop Res, 2019, 4(2):113-119. (in Chinese)

吳江怡, 陳昊, 楊柳. 骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物及生物制劑治療現(xiàn)狀. 骨科臨床與研究雜志, 2019, 4(2):113-119.

Study on preparation and biocompatibility of the acellular dermal matrix/biomineralized collagen diphasic osteochondral integrated scaffold

ZHENG Rui,JIE Yong-sheng, CHEN Lei, JIN Shao-feng, QI Hui, SUN Lei, SHU Xiong

Beijing Jishuitan Hospital, Beijing Institute of Traumatology and Orthopaedics, Beijing 100035, China.

To manufacture an acellular dermal matrix/biomineralized collagen diphasic osteochondral scaffold and then evaluate the physical and chemical properties, biomechanics and biocompatibility of the scaffold to provide theoretical basis for the repair of osteochondral defects.

Bovine acellular dermal matrix was prepared by physical and chemical methods such as acellular, pepsin and cross-linking. Bone-cartilage integrated biphasic scaffolds with acellular dermal matrix (ADM) as cartilage layer and biomineralized collagen (DCS) as bone layer were prepared by mixing tricalcium phosphate and collagen in different proportions and using self-assembly and freeze-drying technology. We constructed the acellular dermal matrix scaffold (ADM), biomineralized collagen scaffold (DCS), and ADM/DCS scaffold (ADM/DCS), respectively, and then the physical and chemical properties and mechanical properties of osteochondral integrated scaffolds were evaluated by gross observation, scanning electron microscopy and biomechanical testing. The primary cultured chondrocytes and osteoblasts cells of mice were implanted into acellular dermal matrix and biomineralized collagen, respectively. The scaffold was observed by cytotoxicity, dead/living cell staining and proliferation experiments.

Gross observation showed that the scaffolds were closely interlaminar, without obvious discontinuity and separation. The pore structures in each layer of the scanning electron microscope were interconnected and multidimensional. The pore sizes of ADM, DCS and biphasic scaffolds were (121.6 ± 8.65), (98.40 ± 5.56) and (103.2 ± 3.94) μm, respectively. At the same time, the compression modulus of the three groups of scaffolds were (41.05 ± 11.69), (108.0 ± 12.71) and (84.98 ± 8.51) kPa, and the elastic modulus were (17.24 ± 3.93), (28.98 ± 3.31) and (21.74 ± 2.92) kPa. The result from MTT assay showed that the osteochondral scaffold had no cytotoxicity. Cells grew evenly on the scaffold, indicating that the scaffolds had good biocompatibility. The data from CCK8 experiments showed that the scaffold possessed excellent biocompatibility.

The physical and chemical properties between the upper and lower layers of the ADM/DCS biphasic scaffolds demonstrate the dual biomimetic structure and mechanics of osteochondral tissue, which lays a foundation for further researchexperiments. Meanwhile, it becomes a new method for osteochondral defect repair.

Acellular dermal matrix; Biomineralized collagen; Diphasic scaffold; Osteochondral

SHU Xiong, Email: shuxiong654321@aliyun.com; SUN Lei, Email:dr_sunlei@263.net

北京市屬醫(yī)學(xué)科研院所科技發(fā)展項(xiàng)目（PXM2017_026275_ 000004）

舒雄，Email：shuxiong654321@aliyun.com；孫磊，Email：dr_sunlei@263.net

2019-01-17

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.02.004