溫海燕 宋金春

(武漢大學人民醫(yī)院藥學部，湖北省武漢市 430060，電子郵箱：wenhaiyan2000@126.com)

膦甲酸鈉為非核苷類的抗病毒藥物，可有效阻斷病毒DNA復制，具有廣譜抗病毒作用[1]。膦甲酸鈉在臨床上主要以注射液進行全身給藥，常用于治療艾滋病相關的巨細胞病毒感染、抗耐核苷類藥物病毒等，療效顯著。膦甲酸鈉在體內(nèi)主要的毒性靶器官為腎臟，因此在臨床抗病毒治療過程中易產(chǎn)生腎毒性[2-5]。此外，肝臟也是藥物代謝的一個重要器官。目前，尚無膦甲酸鈉對肝腎功能影響的研究。本研究分析不同劑量膦甲酸鈉對大鼠肝腎組織及相關生化病理指標的影響，為臨床安全應用膦甲酸鈉提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 膦甲酸鈉氯化鈉注射液(批號：21707072-1；規(guī)格：3 g:250 ml)與膦甲酸鈉原料藥均由武漢大安制藥有限公司生產(chǎn)(批號：1704261)，無菌生理鹽水，甲醇、乙腈(色譜純)，4%多聚甲醛溶液。

1.2 主要儀器 ADVIA 2400型全自動生化分析儀由西門子公司生產(chǎn)，Sorvall Fresco型微量臺式離心機由德國賀利氏公司生產(chǎn)，YXJ-1型高速離心機由深圳天南海北實業(yè)有限公司生產(chǎn)，XW-80A型渦旋混合儀由上海醫(yī)科大學儀器廠生產(chǎn)，TG328A型電子分析天平由上海天平儀器廠生產(chǎn)，ECLIPSE Ti-SR型倒置熒光顯微鏡由日本尼康公司生產(chǎn)，DS-U3型成像系統(tǒng)由日本尼康生產(chǎn)。

1.3 實驗動物及分組 無特定病原體級SD大鼠40只由湖北省實驗動物研究中心提供[湖北省實驗動物質(zhì)量合格證號：42000600025186；許可證號：SYXK(鄂)2015-0018]，雌雄各半，體重(200±30)g。以標準飼料和飲用水喂養(yǎng)，室內(nèi)溫度為(23±2)℃，相對濕度為60%～70%，12 h交替照明。待適應環(huán)境后采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只。低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠分別給予腹腔注射300 mg/kg、600 mg/kg、900 mg/kg的膦甲酸鈉注射液，對照組給予腹腔注射等體積生理鹽水。每日上午10時稱大鼠體重后，根據(jù)體重給予藥物，連續(xù)注射2周。

1.4 觀察指標

1.4.1 一般情況：在給藥期間內(nèi)觀察動物的狀況，包括毛發(fā)、糞便與尿液、行為動作、體重變化等。每天給藥后稱重計算當天的體重增長率，最終取2周體重增長率的平均值，體重增長率=(給藥后的體重-未給藥前的體重)/未給藥前體重×100%。

1.4.2 尿液指標：給藥2周后，用代謝籠收集大鼠24 h尿液，采用全自動生化分析儀測定尿總蛋白、尿肌酐指標，計算內(nèi)生肌酐清除率(creatinine clearance，CCr)，CCr=尿肌酐/血肌酐×每分鐘的尿量(ml/min)。

1.4.3 血液指標：給藥2周后，自大鼠心臟抽取全血3 ml后處死，置離心管中于室溫靜置1 h后，于3 500 r/min離心10 min，分離血清，用全自動生化分析儀檢測血清ALT、AST、尿素氮、肌酐、TG及AKP濃度。

1.4.4 肝腎組織形態(tài)學改變情況： 大鼠處死后完整分離肝臟及雙側(cè)的腎臟組織，用生理鹽水沖洗去除多余組織和污血，用紗布輕輕吸干多余水分后稱量，根據(jù)臟器質(zhì)量及大鼠體重數(shù)計算相應的臟器系數(shù)。臟器指數(shù)(%)=臟器重量(g)/大鼠體重(g)×100%。取大鼠肝臟的同一部位組織及同一側(cè)的腎臟組織，用4%多聚甲醛進行固定，依次進行脫水、包埋、切片、脫蠟、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色后，于光學顯微鏡下觀察組織形態(tài)學變化。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 給藥期間，對照組及低劑量組大鼠一般情況良好，飲食、毛發(fā)、行為均正常，未出現(xiàn)死亡。中、高劑量組大鼠出現(xiàn)脫毛，每次給藥后的2～3 h內(nèi)出現(xiàn)四肢抽搐，精神狀況差，食欲不振的現(xiàn)象，當日下午該現(xiàn)象基本消失。此外，高劑量組大鼠還存在腹瀉，尿液變黃，消瘦等現(xiàn)象，其中中劑量組大鼠未出現(xiàn)死亡，高劑量組在后期給藥過程中出現(xiàn)4只死亡，補入相應數(shù)量的大鼠繼續(xù)進行給藥滿2周。

2.2 4組大鼠體重增長率及臟器指數(shù)比較 與對照組相比，低劑量組體重增長率和肝臟指數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，但腎臟指數(shù)高(P<0.05)；與對照組及低劑量組相比，中劑量組和高劑量組的體重增長率均低，而肝臟及腎臟指數(shù)均高(均P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠體重增長率及臟器指數(shù)比較(x±s，%)

注：與對照組比較，*P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05。

2.2 4組大鼠肝、腎病理組織形態(tài)改變 (1)正常對照組的大鼠肝臟結(jié)構完整清晰，肝細胞呈多面體型，肝細胞索排列清晰，從中央靜脈向四周呈輻射狀整齊排列，細胞核清晰可見，部分存在雙核，內(nèi)皮細胞扁平，環(huán)繞在中央靜脈周圍，血竇清晰，組織無腫脹壞死現(xiàn)象；低劑量組大鼠肝臟與對照組形態(tài)相似；而中、高劑量組大鼠肝細胞腫脹變大，細胞間界限模糊，肝細胞索排列趨于紊亂，血竇模糊，中央靜脈變小。見圖1。(2)對照組大鼠的腎臟結(jié)構完整，腎小球清晰無破損，腎小球囊腔大小均勻，腎小管刷邊界正常；低劑量組大鼠的腎小球囊腔變大，腎小管排列形態(tài)發(fā)生改變，腎小管刷邊界模糊；中、高劑量組大鼠的病變加重，腎臟結(jié)構完整性破壞，腎小管與腎小球排列紊亂，腎小管上皮細胞和腎小球細胞出現(xiàn)空泡樣病變，腎小管囊腔面積很大，近曲小管上皮細胞發(fā)生脫落，腎臟結(jié)構嚴重受損。見圖2。

對照組 低劑量組 中劑量組 高劑量組

圖1 4組大鼠肝臟病理組織切片(HE染色，×400)

對照組 低劑量組 中劑量組 高劑量組

圖2 4組大鼠腎臟病理組織切片(HE染色，×400)

2.3 4組大鼠肝腎功能相關指標比較 (1)肝功能：給藥2周后，與對照組相比，低劑量組的AST及AKP均高(均P<0.05)；與對照組及低劑量組相比，高、中劑量組的ALT、AST、AKP及TG水平均高(均P<0.05)，見表2。(2)腎功能：與對照組相比，低高劑量組血尿素氮及肌酐、尿液總蛋白均高(均P<0.05)，而尿肌酐以及CCr值均低(均P<0.05)； 與對照組及低劑量組相比，中、高劑量組血尿素氮及肌酐、尿液總蛋白均高(均P<0.05)，而尿肌酐以及CCr值均低(均P<0.05)，見表3。

表2 4組大鼠給藥后肝功能比較(x±s)

注：與對照組比較， *P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05。

表3 4組大鼠給藥后腎功能比較(x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05。

3 討 論

3.1 給藥劑量的確定 參考文獻[6-7]及膦甲酸鈉的說明書，根據(jù)治療疾病及患者狀況對其劑量進行個體化調(diào)整。膦甲酸鈉用于病毒感染誘導治療的劑量為60 mg/kg，維持劑量為90～120 mg/kg，而用于皮膚感染治療的劑量為40 mg/kg。根據(jù)人與大鼠等劑量之間的換算[8]，成人的體重視為標準體重60 kg，成人劑量按皮膚感染治療(40～60 mg/kg)的中間劑量，即50 mg/kg計算，將成人劑量與大鼠劑量按體表面積等效劑量進行換算得大鼠劑量為299 mg/kg，同時，為便于計算給藥，按300 mg/kg給藥，并設該劑量為低劑量。此外，根據(jù)膦甲酸鈉的最大溶解度及大鼠腹腔注射的最大注射量，中、高劑量則分別設為低劑量的2、3倍，即600 mg/kg、900 mg/kg。

3.2 膦甲酸鈉對大鼠體重增長率及臟器系數(shù)的影響 在給藥期間，所有大鼠均給予常規(guī)的飲食飼養(yǎng)。對照組與低劑量組大鼠的體重增長穩(wěn)定，而中劑量組大鼠的體重增長較慢，高劑量組大鼠體重則降低。功能正常的動物臟器與體重變化較為穩(wěn)定，兩者的比值即臟器指數(shù)也較為恒定[9]。當臟器受損后，可能會出現(xiàn)充血、水腫、組織異常肥大增生等，這使得臟器系數(shù)增大；而出現(xiàn)器官萎縮時，則臟器指數(shù)減小。本研究中，與對照組比較，中劑量組和高劑量組的體重增長率均低，而肝臟及腎臟指數(shù)均高(均P<0.05)；低劑量組體重增長率和肝臟指數(shù)與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，但腎臟指數(shù)高(P<0.05)。其原因可能為中、高劑量大鼠在給藥過程中出現(xiàn)明顯的腹瀉，食欲不振的現(xiàn)象，體重變化大，使得臟器指數(shù)變大；另外，在給藥后期，高劑量的大鼠出現(xiàn)4只死亡，解剖后發(fā)現(xiàn)其肝臟出現(xiàn)輕微肥大，腎臟顏色變白，出現(xiàn)異常水腫肥大現(xiàn)象，而其他組織正常，這也導致臟器指數(shù)變大。這表明中、高劑量的膦甲酸鈉對大鼠肝臟和腎臟均具有損害作用，而低劑量組對肝臟無顯著的損害作用，但對腎臟具有一定的損害。

3.3 膦甲酸鈉對肝、腎功能及組織形態(tài)學的影響 當肝細胞受損時，存在于其中的ALT、AST會釋放入血，導致其血液含量升高，兩者是評價肝功能的常見指標[10]。AKP主要存在于肝、腎、骨骼等組織，通過肝臟向膽排出。當發(fā)生肝膽病變時，由于肝內(nèi)膽道膽汁排泄障礙，肝細胞過度產(chǎn)生的AKP無法順利排出而反流入血，導致血液中AKP含量升高。TG含量的變化可能與脂肪肝、高血脂等疾病有關[11]。肌酐與尿素含量的變化與腎功能密切相關，兩者都主要通過腎小球濾過排出體外，當腎小球受損時，兩者在血液中無法正常濾過導致含量升高。其中，血肌酐和尿肌酐的變化可通過CCr來反映，當CCr顯著降低時，表明腎小球過濾功能受損。此外，在正常情況下，尿液中不含或僅含微量的蛋白，當腎臟受損時，導致尿蛋白無法重吸收，使得尿液中的蛋白含量上升。

本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，低劑量組部分肝功能指標高，但數(shù)值變化在合理范圍之內(nèi)，且肝臟系數(shù)無明顯變化，組織理形態(tài)也較為完整，提示低劑量膦甲酸鈉對肝臟的損害作用較?。恢?、高劑量組的ALT、AST、AKP及TG水平均高于對照組(均P<0.05)，且大鼠肝臟的組織形態(tài)存在一定的破壞，但在病理組織圖中肝臟紋路較為清晰，提示中、高劑量膦甲酸鈉可損害肝臟，但損害作用較輕，該作用機制還待進一步研究。而與對照組相比，不同劑量組血尿素氮及肌酐、尿液總蛋白均高(均P<0.05)，而尿肌酐以及CCr值均低(均P<0.05)，腎小管和腎皮質(zhì)均出現(xiàn)不同程度的破壞，其中中、高劑量組大鼠的腎臟結(jié)構嚴重受損，提示不同劑量膦甲酸鈉均可損害腎臟，且較肝臟損害更為嚴重。這可能是由于高劑量的膦甲酸鈉經(jīng)腎臟排泄過程中產(chǎn)生結(jié)晶，從而造成腎臟損傷，但通常這種損傷都是可逆的，停藥一段時間后恢復[12-13]。有研究表明，靜脈注射一定量的生理鹽水或飲用大量水可水化膦甲酸鈉，明顯降低腎毒性[14-15]。此外，與低劑量組相比，中、高劑量組ALT、AST、AKP、TG、血尿素氮及肌酐、尿液總蛋白均高(均P<0.05)，而尿肌酐以及CCr

值均低(均P<0.05)，提示隨著劑量增大，膦甲酸鈉對肝臟及腎臟的損害越顯著。

綜上所述，連續(xù)使用膦甲酸鈉可損害肝腎功能，對腎臟的損害更嚴重，而中、高劑量膦甲酸鈉的作用更為明顯。在臨床應用中，需個體化調(diào)整膦甲酸鈉的給藥劑量和療程，最大限度地保證療效和用藥安全性，減少不良反應。