陳文艷 杜欣娜 樊偉平 莊 瑩 趙小芳 孫海燕 張 虎

(江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，2 護(hù)理學(xué)院，鹽城市 224005，電子郵箱：18261908663@163.com)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升，且具有年輕化的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性健康，影響生活質(zhì)量[1]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，REST協(xié)阻抑制因子3(REST corepressor 3，RCOR3)基因高表達(dá)的乳腺癌患者預(yù)后相對(duì)好，可作為乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)的潛在標(biāo)志物?；虮磉_(dá)受多種因素的影響，如基因拷貝數(shù)變化、DNA甲基化修飾、組蛋白乙?；刃揎?、轉(zhuǎn)錄因子和非編碼RNA等[2-3]。微小RNA(microRNA，miRNA)作為一種普遍存在的靶向抑制基因表達(dá)的非編碼RNA，可以調(diào)控人類1/3的基因表達(dá)。MiRNA因具有腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡和耐藥等重要生物學(xué)功能而成為腫瘤基因治療的潛在靶點(diǎn)[4-5]。通過(guò)軟件預(yù)測(cè)和高通量數(shù)據(jù)驗(yàn)證可以快速找到靶向調(diào)節(jié)基因表達(dá)的miRNA，而通過(guò)后續(xù)細(xì)胞和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，可以進(jìn)一步加速揭示基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，為腫瘤診斷、預(yù)防和治療提供潛在靶點(diǎn)。因此，本文用5種不同軟件預(yù)測(cè)靶向抑制RCOR3基因表達(dá)的miRNA，取交集后，通過(guò)多組學(xué)高通量數(shù)據(jù)初步驗(yàn)證miRNA對(duì)RCOR3表達(dá)的抑制作用，為調(diào)控RCOR3的表達(dá)提供潛在靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 預(yù)測(cè)靶向抑制RCOR3表達(dá)的miRNA 登錄StarBase V2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)[6]，選擇miRNA-Target intersections，得到分別由RNA22、miRanda、PicTar、TargetScan和PITA5種軟件預(yù)測(cè)靶向抑制RCOR3表達(dá)的miRNA，取交集。

1.2 高通量數(shù)據(jù)驗(yàn)證乳腺癌組織中miRNA對(duì)RCOR3表達(dá)的抑制作用 登錄LinkedOmics網(wǎng)站(http://www.linkedomics.org/login.php)[7]，癌癥類型選擇“TCGA_BRCA”，檢索數(shù)據(jù)集選擇“HiSeq RNA”，輸入基因“RCOR3”，靶數(shù)據(jù)集選擇“miRNASeq”，統(tǒng)計(jì)方法選擇“Spearman Correlation Test”，提交，下載結(jié)果，驗(yàn)證乳腺癌中miRNA-128-3p、miRNA-27a、miRNA-27b及miRNA-19b-3p與靶分子RCOR3表達(dá)的相關(guān)性，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 泛癌癥分析驗(yàn)證miRNA對(duì)RCOR3的抑制作用 登錄StarBase V2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)[6]，選擇“miRNA-target intersections”，miRNA中分別輸入“hsa-miRNA-128-3p”、“has-miRNA-27a” “miRNA-27b” 及 “miRNA-19b-3p”，Gene Symbol中輸入“RCOR3”，點(diǎn)擊查詢。彈出頁(yè)面中點(diǎn)擊最右側(cè)“CancerNum”下的鏈接，下載結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 靶向抑制RCOR3基因表達(dá)的miRNA預(yù)測(cè)結(jié)果 分別利用RNA22、miRanda、PicTar、TargetScan和PITA軟件預(yù)測(cè)靶向抑制RCOR3表達(dá)的miRNA，取交集后得到miRNA-128-3p、miRNA-27a、miRNA-27b、miRNA-19b-3p，見圖1。

圖1 靶向抑制RCOR3基因表達(dá)的miRNA預(yù)測(cè)結(jié)果

2.2 高通量數(shù)據(jù)驗(yàn)證結(jié)果 通過(guò)LinkedOmics驗(yàn)證miRNA與靶分子RCOR3表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示乳腺癌中miRNA-128-3p、miRNA-27a、miRNA-27b、miRNA-19b-3p的表達(dá)均與靶分子RCOR3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.240，P<0.001；rs=-0.237，P<0.001；rs=-0.188，P<0.001；rs=-0.171，P=0.002)，見圖2。

圖2 乳腺癌中miRNA-128-3p、miRNA-27a、miRNA-27b、miRNA-19b-3p表達(dá)與RCOR3表達(dá)的相關(guān)性

2.3 泛癌癥分析驗(yàn)證結(jié)果 泛癌癥分析結(jié)果顯示，除乳腺癌之外，結(jié)直腸腺癌、肺腺癌、腎透明細(xì)胞癌和子宮內(nèi)膜癌組織中miRNA-128-3p與RCOR3的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)，見表1；結(jié)直腸腺癌、膀胱尿路上皮癌、肺腺癌、肺鱗癌、腎透明細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌和急性髓性白血病中miRNA-27a與RCOR3的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)，見表2。

表1 miRNA-128-3p與RCOR3表達(dá)相關(guān)性的泛癌癥分析

表2 miRNA-27a與RCOR3表達(dá)相關(guān)性的泛癌癥分析

3 討 論

miRNA是體內(nèi)一類長(zhǎng)度為21～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，其主要通過(guò)完全或不完全互補(bǔ)結(jié)合至靶基因的3′非編碼區(qū)而調(diào)控靶基因的表達(dá)。鑒于miRNA抑制靶基因表達(dá)的機(jī)制較為明確，研究人員開發(fā)出多種計(jì)算方法和在線軟件用來(lái)預(yù)測(cè)靶向調(diào)節(jié)基因表達(dá)的miRNA。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)RCOR3基因是潛在的乳腺癌抑癌基因，因此，在本研究中我們利用多種在線軟件預(yù)測(cè)靶向調(diào)節(jié)RCOR3基因表達(dá)的miRNA，取交集后得到四種miRNA，即miRNA-128-3p、miRNA-27a、miRNA-27b、miRNA-19b-3p。miRNA-128 在多種疾病和正常組織中均不同程度的表達(dá)，具有廣泛的調(diào)節(jié)作用。在許多人類腫瘤中均能檢測(cè)到miRNA-128的異常表達(dá)，其參與癌癥相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程，例如細(xì)胞增殖、分化和凋亡[8]。研究表明，miRNA-128-3p通過(guò)靶向調(diào)節(jié)E盒結(jié)合鋅指蛋白1而抑制食管鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[9]；miRNA-128通過(guò)靶向調(diào)節(jié)環(huán)氧化酶-2抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[10]，外周血循環(huán)miRNA-128還可作為膠質(zhì)瘤的潛在診斷生物標(biāo)志物[11]。另外，miRNA-128可以通過(guò)抑制c-Met/磷脂?；?-激酶/蛋白激酶B途徑逆轉(zhuǎn)肺癌干細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥性[12]。以上研究結(jié)果均提示miRNA-128通過(guò)多種基因介導(dǎo)參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。miRNA-27a分為miRNA-27a-3p和miRNA-27a-5p兩個(gè)亞型，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)這兩種亞型在胃癌組織和細(xì)胞系中均高表達(dá)，但miRNA-27a-3p為主要亞型，其表達(dá)水平顯著高于miRNA-27a-5p，并可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖能力[13]。近年來(lái)研究表明，miRNA-27a-3p可抑制肝癌、鼻咽癌、骨肉瘤等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)可作為三陰乳腺癌的潛在預(yù)后標(biāo)志物[14-17]。

miRNA調(diào)節(jié)靶基因的機(jī)制明確，均為靶向抑制作用，據(jù)此本研究進(jìn)一步通過(guò)miRNA組學(xué)和RNA-seq組學(xué)高通量數(shù)據(jù)分析，驗(yàn)證了乳腺癌中miRNA-128-3p、miRNA-27a、miRNA-27b及miRNA-19b-3p與靶基因RCOR3的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)，提示miRNA-128-3p、miRNA-27a、miRNA-27b及miRNA-19b-3p均可以靶向抑制RCOR3的表達(dá)。而且泛癌癥分析顯示多種癌癥中miRNA-128-3p和miRNA-27a均具有一定的保守性。

綜上所述，乳腺癌中miRNA-128-3p、miRNA-27a、miRNA-27b及miRNA-19b-3p與RCOR3表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)，具有潛在的靶向抑制RCOR3表達(dá)的功能。