郭冰潔，苑廣信，張 靜，安麗萍，杜培革，徐廣宇，韓 笑

(北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林吉林 132013)

鹿骨為鹿科動物梅花鹿(Cervushortulorum)或馬鹿(Cervuselaphus)的骨骼，營養(yǎng)物質(zhì)豐富，含有大量的蛋白質(zhì)、磷脂質(zhì)、磷蛋白、維生素，還含有鈣、鎂、鐵、鋅、鉀等微量元素，參與人體的多種代謝，具有重要的藥理作用[1]。《本草綱目》中記載：“鹿骨，甘，微熱，無毒，續(xù)斷傷，補(bǔ)骨除風(fēng)；燒灰水服，治小兒洞注下痢[2]”。另有記載：“虎難捕，可用鹿骨代之。鹿食草，其骨性溫良而悠長”。大量研究證實(shí)，鹿骨多肽可治療骨質(zhì)疏松，延緩衰老，且對人體無毒副作用，具有水溶性強(qiáng)、活性高等特點(diǎn)，可作為天然活性蛋白多肽的可靠來源。

大量研究證實(shí)，活性氧(ROS)自由基與衰老和許多慢性疾病有關(guān)[3]，正常情況下，ROS自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡，適量的自由基可促進(jìn)代謝,過量會引起人體自身的氧化應(yīng)激損傷，久之成疾[4]?！H、O2·-自由基是機(jī)體有氧代謝的中間體，在體內(nèi)存在狀態(tài)不穩(wěn)定[5]，易引起周圍組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞的膜蛋白，損傷細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而使蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA等生物大分子受到不同程度的損傷[6]。該研究采用熱水抽提法提取鹿骨中的蛋白質(zhì)，骨膠即為骨膠原蛋白的熱提取產(chǎn)物，并用酶進(jìn)行水解，對其體外抗氧化活性及對正常PC12細(xì)胞的影響和H2O2氧化損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1材料與試劑鹿骨購自吉林市龍?zhí)渡较蜿柭箯S；PC12細(xì)胞，北華大學(xué)藥理教研室贈送。胃蛋白酶(600～1 000 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg),購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)購自東京化成工業(yè)株式會社；VC購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自HyClone公司；胎牛血清購自杭州天杭生物科技股份有限公司；BCA試劑盒、Folin-酚試劑盒均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為分析純，水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

1.2儀器與設(shè)備ATY224型電子天平，日本SHIMADZU；Five Easy plus 型pH計(jì)，瑞士METTLER TOLEDO；冷凍干燥機(jī)，美國SP Scientific-Vritis BenchTop Pro；Infinite M200型酶標(biāo)儀，瑞士TECAN； Thermo Mixer C型恒溫振蕩器，德國EPPENDORF； UV-2550型紫外分光光度計(jì)，日本SHIMADZU。

1.3方法

1.3.1工藝流程。新鮮鹿骨→粉碎→脫脂→脫鈣→干燥→提取→鹿骨膠粗提液→胃酶酶解→胰酶酶解→堿性蛋白酶酶解→終止酶解→離心取上清→凍干得鹿骨膠水解物(HDBG)干粉。

1.3.2鹿骨膠水解物制備。

1.3.2.1預(yù)處理。將鹿骨剔去肉和筋膜，粉碎過40目篩，石油醚浸泡24 h，常溫?fù)]干，0.5 mol/L HCl脫鈣，每3 h換一次酸液，干燥得脫脂脫鈣骨粉。

1.3.2.2鹿骨多肽制備。①取預(yù)處理鹿骨，于121 ℃ 0.15 MPa ，料液比為1∶10條件下提取2 h，合并2次提取液，減壓濃縮，凍干得鹿骨膠干粉。②鹿骨膠溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%)，胃蛋白酶37 ℃，pH=2.0酶解4 h，胰蛋白酶酶解37 ℃，pH=8.0酶解4 h，酶底比均為1∶500(m∶V)，堿性蛋白酶45 ℃，pH=10.0酶解2 h，酶底比為1∶200(m∶V)，沸水浴10 min終止酶解，10 000 r/min離心20 min上清即為鹿骨膠水解液(HDBG)，凍干得鹿骨膠水解物干粉。

1.3.3鹿骨蛋白含量測定。采用凱氏定氮法(參照GB/T 5009.5—2010)測定蛋白質(zhì)，計(jì)算公式為：

X=[(V1-V2)×c×0.014 0]/(m×V3/100)×F×1 000

(1)

式中，X為蛋白質(zhì)含量(g/kg)；V1為樣品消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液體積(mL)；V2為空白組消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液體積(mL)；V3為吸取樣品消化液體積(mL)；c為1.0 mL鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液濃度(mol/L)；0.014 0為1.0 mL鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量；m為樣品質(zhì)量；F為換算系數(shù)。

1.3.4抗氧化試驗(yàn)。

1.3.4.1DPPH自由基清除率測定[3，7-9]。用95%乙醇配制0.2 mmol/L DPPH，避光保存，備用。吸取不同濃度的HDBG 100 μL樣品于96孔板中，加入100 μL DPPH溶液，充分搖勻，25 ℃孵箱反應(yīng)30 min，517 nm處測定吸光度值A(chǔ)i，相同條件下，樣品與95%乙醇吸光度值A(chǔ)j，水與DPPH吸光度值A(chǔ)0，水與95%乙醇吸光度值A(chǔ)空白；VC為陽性對照；每樣品平行測定3次，取均值。清除率公式為:

(2)

1.3.4.2羥自由基(·OH)清除率測定[9-10]。該研究采用Fenton體系，H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生·OH，在體系內(nèi)加入水楊酸產(chǎn)生·OH并生成有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm下有最大吸收。用95%乙醇配制10 mmol/L水楊酸溶液，避光保存；去離子水配制10 mmol/L FeSO4溶液，10 mmol/L H2O2溶液，備用。依次吸取各溶液50 μL于96孔板，加入50 μL不同濃度HDGB，避光搖勻10 min，加入50 μL H2O2啟動反應(yīng)，37 ℃孵箱反應(yīng)30 min，510 nm處測定吸光度值A(chǔ)i，相同條件下，樣品+FeSO4+水楊酸+水吸光度值A(chǔ)j；水+FeSO4+水楊酸+ H2O2吸光度值A(chǔ)0；VC為陽性對照；每樣品平行測定3次，取均值。清除率公式為：

(3)

1.3.5HDBG對H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷的修復(fù)作用。

1.3.5.1樣品配制。取HDBG凍干粉30 mg用DMEM培養(yǎng)基定容至2 mL，分別稀釋至1 500、750 、250 μg/mL，備用。

1.3.5.2HDBG對正常PC12細(xì)胞的影響[11-12]。取對數(shù)生長期的PC12(8.0×104個(gè)/mL)，接種到96孔板中，設(shè)置空白對照組、正常對照組和HDBG給藥組(低劑量組250 μg/mL、中劑量組750 μg/mL、高劑量組1 500 μg/mL)，HDBG給藥組每孔加入100 μL單細(xì)胞懸液，空白對照組加100 μL培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，給藥組加不同濃度的HDBG溶液100 μL，其他組每孔加入培養(yǎng)液100 μL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，利用MTT法，在490 nm處測定吸光度值OD，取平均值計(jì)算細(xì)胞活力。

(4)

式中，OD0為空白組OD值；OD1為試驗(yàn)組OD值；OD2為對照組OD值。

1.3.5.3H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷模型的構(gòu)建[13-16]。將對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞(8.0×104個(gè)/mL)，接種到96孔板中，設(shè)置空白對照組、H2O2損傷組(終濃度為100、200、300、400 μmol/L)和正常對照組；正常對照組和不同濃度H2O2損傷組每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，空白對照組加100 μL培養(yǎng)液，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h后向損傷組加不同濃度的H2O2溶液100 μL，其他組每孔加入培養(yǎng)液100 μL。在1、2、3、4 h時(shí)，吸出舊培養(yǎng)液，加入200 μL新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后。用MTT法，490 nm處測定吸光度值A(chǔ)，取平均值計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞存活力50%左右時(shí)的條件為最佳損傷條件。

1.3.5.4HDBG對 H2O2損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用[17-20]。將對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清)，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)3 d，消化處理，稀釋至8×104cell/mL，每孔100 μL接種于96孔板中，設(shè)置空白組、給藥組、正常對照組，培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁，給藥組加入損傷劑H2O2100 μL，終濃度為200 μmol/L，空白組加入100 μL培養(yǎng)液，恒溫培養(yǎng)3 h后，吸出舊培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 新培養(yǎng)液，每樣品設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，具體如下：①樣品組。高劑量組，100 μL細(xì)胞+100 μL 1 500 μg/mL HDBG(經(jīng)H2O2損傷)；中劑量組，100 μL細(xì)胞+100 μL 750 μg/mL HDBG(經(jīng)H2O2損傷)；低劑量組，100 μL細(xì)胞+100 μL 250 μg/mL HDBG(經(jīng)H2O2損傷)。②對照組，100 μL細(xì)胞+100 μL DMEM培養(yǎng)基(未經(jīng)H2O2損傷)。③空白組，100 μL DMEM培養(yǎng)基+100 μL HDBG。

加好樣品的96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)后，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h，吸棄孔內(nèi)所有培養(yǎng)基，然后每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)振蕩溶解10 min，490 nm測定OD值。細(xì)胞活力公式為：

(5)

式中，OD0為空白組OD值；OD1為試驗(yàn)組OD值；OD2為對照組OD值。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析每組試驗(yàn)平行測定3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。 試驗(yàn)結(jié)果用Graphpad Prism 6 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1鹿骨膠水解物含量測定鹿骨膠是骨膠原蛋白的熱提取產(chǎn)物，該試驗(yàn)中鹿骨膠干粉產(chǎn)率為10.3%，其中蛋白含量為51.2%。因此其水解物主要成分為鹿骨多肽，水解物肽純度493 g/kg。

2.2鹿骨膠水解物對DPPH的清除作用由圖1可知，HDBG可有效地清除試驗(yàn)體系中的DPPH自由基，不同濃度的HDBG對DPPH自由基的清除效果存在差別，當(dāng)質(zhì)量濃度小于10 mg/mL時(shí)，隨HDBG濃度增加，清除率迅速升高；在10～30 mg/mL時(shí)清除率與HDBG濃度呈劑量依賴關(guān)系；30 mg/mL時(shí)，最大清除率為74.63%，當(dāng)濃度大于30 mg/mL時(shí)，清除率增加趨于平緩，其IC50=10.05 mg/mL。

圖1 鹿骨水解物對DPPH自由基的清除率Fig.1 The scavenging rate of DPPH free radicals by HDBG

2.3鹿骨膠水解物對·OH的清除作用由圖2可知，HDBG對試驗(yàn)體系中的·OH自由基有顯著的清除作用(P<0.05)，不同濃度的HDBG對·OH自由基的清除效果存在差別，當(dāng)質(zhì)量濃度小于16 mg/mL時(shí)，清除率與HDBG濃度呈劑量依賴關(guān)系；當(dāng)濃度大于16 mg/mL時(shí)，清除率無顯著增加，在16 mg/mL時(shí)達(dá)最大清除率87.69%，其IC50=4.76 mg/mL。

圖2 鹿骨水解物對·OH自由基的清除率Fig.2 The scavenging rate of ·OH by HDBG

2.4HDBG對H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷的修復(fù)作用

2.4.1HDBG對正常PC12細(xì)胞的影響。由圖3可知，當(dāng)給藥濃度為250 μg/mL時(shí)，48 h的細(xì)胞活力為111.31%(P<0.05)，與對照組相比具有顯著的差異。給藥濃度為750、1 500 μg/mL時(shí)，與對照組相比，24 h、48 h的細(xì)胞活力均有極顯著(P<0.01)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明HDBG對PC12細(xì)胞無毒副作用，1 500 μg/mL時(shí)，48 h時(shí)，最大細(xì)胞活力達(dá)159.83%。

注：*、**表示與對照組相比，差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)Note:*,** indicates that the difference is significant and extremely significant compared with the control group圖3 HDBG對正常PC12細(xì)胞的影響Fig.3 Effect of HDBG concentration on normal PC12 cell

2.4.2H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷模型的構(gòu)建。由圖4可知，損傷隨著H2O2濃度的升高及時(shí)間的延長，模型表現(xiàn)氧化損傷逐漸加重。當(dāng)200 μmol/L的H2O2損傷3 h時(shí)，細(xì)胞活力為52.02%，與正常對照組相比，有顯著性差異(P<0.05)。因此，模型選用200 μmol/L的H2O2處理PC12細(xì)胞3 h作為細(xì)胞氧化損傷條件。

圖4 H2O2濃度對細(xì)胞活力的影響Fig.4 Effect of H2O2 concentration on cell activity

2.4.3鹿骨膠水解物對H2O2損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用。由圖5可知，經(jīng)H2O2損傷后，細(xì)胞活力降為52.29%，與對照組相比具有顯著(P<0.01)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明氧化損傷細(xì)胞模型造模成功。當(dāng)HDBG在250 μg/mL時(shí)，PC12細(xì)胞活力無明顯升高；750 μg/mL的濃度下，使細(xì)胞活力增加至73.16%(P<0.05)，對損傷的細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用；當(dāng)HDBG濃度為1 500 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞活力升至82.43%(P<0.05)。綜上所述，HDBG高、中、低劑量組均可增加細(xì)胞活力，表明不同濃度HDBG可對氧化損傷的PC12細(xì)胞具有不同程度的保護(hù)作用，且呈明顯的劑量依賴性。

注：*表示t檢驗(yàn)中,與損傷組比較差異顯著(P<0.05)；##表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)Note: * indicates significant difference compared with the injury group (P<0.05) in t test;## indicates significant difference compared with the control group (P<0.05)圖5 HDBG對PC12的氧化損傷保護(hù)作用Fig.5 Protective effects of HDGB on oxidative injury in PC12

3 討論與結(jié)論

ROS自由基過多能直接或間接地引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，損傷細(xì)胞膜、酶、DNA等，使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，并引起衰老和各種慢性退行性疾病[21]。如今應(yīng)用的合成抗氧化劑安全尚不可靠，因此，開發(fā)來源安全的食品抗氧化劑具有重要意義。鹿骨膠水解物的抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，鹿骨膠水解物對DPPH和·OH均具有良好的清除能力。其中DPPH的IC50值為10.05 mg/mL，·OH的IC50值為4.76 mg/mL。該試驗(yàn)結(jié)果為鹿骨多肽的藥物開發(fā)提供了理論依據(jù)。

PC12細(xì)胞由大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤分離得到，在功能和形態(tài)上均與神經(jīng)細(xì)胞相似[22]，H2O2誘導(dǎo)PC12神經(jīng)細(xì)胞損傷模型是模擬體內(nèi)自由基誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程，因此，可作為多種神經(jīng)性疾病的體外細(xì)胞模型[23-25]。H2O2誘導(dǎo)PC12神經(jīng)細(xì)胞損傷試驗(yàn)結(jié)果表明，鹿骨膠水解物濃度在250 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活力略高于損傷組，無顯著增加。當(dāng)濃度為750 μg/mL時(shí)，對氧化損傷的PC12細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用，細(xì)胞活力由52.29%上升至73.16%(P<0.05)，在濃度1 500 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活力達(dá)82.43%(P<0.05)，HDBG對正常的PC12細(xì)胞具有增殖作用，說明其無細(xì)胞毒性，對氧化損傷的PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用，且與水解物濃度呈劑量依賴關(guān)系。

我國是畜牧大國，禽畜骨骼年產(chǎn)量巨大，多數(shù)因不能充分利用造成嚴(yán)重的浪費(fèi)，因此動物骨膠原蛋白多肽的研究具有深遠(yuǎn)意義。骨骼中大量的優(yōu)質(zhì)蛋白及多肽，對人體無毒副作用，可作為天然活性蛋白多肽的可靠來源，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，骨多肽勢必會成為研究熱點(diǎn)。該研究為鹿骨多肽的功能產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)，鹿骨膠水解物主要成分為多肽，具有良好的抗氧化活性，可預(yù)期鹿骨多肽在抗衰老、抗癌和神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的生命系統(tǒng)的氧化損傷中的重要保護(hù)作用， 為鹿骨多肽的進(jìn)一步研究提供了新思路。