吳 雯，李 萍，左 然，

曾慶波2，4，吳德生2，謝 妮3，

龍鼎新1，*，袁建輝1，4，5，*

(1．南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 衡陽(yáng)

421001；2．深圳市疾病預(yù)防控制中心毒理研究所，廣東 深圳 518055；3．深圳市第二人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，廣東 深圳 518000；

4．中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510080；

5．深圳市南山區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣東深圳 518054)

DNA甲基化是哺乳動(dòng)物基因組中最常見(jiàn)的表觀遺傳修飾之一，是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)的催化作用下發(fā)生的共價(jià)修飾過(guò)程。已知有活性的DNMT有3種：DNMT1、DNMT3A和DNMT3B，DNMT1主要負(fù)責(zé)維持性甲基化，DNMT3A和DNMT3B主要參與從頭甲基化。在腫瘤組織中，可以觀察到DNMT3B顯著過(guò)表達(dá)，DNMT1和DNMT3A的過(guò)表達(dá)則不明顯[1-2]。

DNMT3B位于人染色體20q11.2上，有23個(gè)外顯子和22個(gè)內(nèi)含子，其主要結(jié)構(gòu)包括：高度可變的N-末端、PWWP結(jié)構(gòu)域、鋅結(jié)合位點(diǎn)及具有催化功能的C-末端[3-4]。研究報(bào)道，DNMT3B啟動(dòng)子區(qū)有3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)：?jiǎn)?dòng)子區(qū)-283T＞C(外顯子1A為起始點(diǎn))單核苷酸多態(tài)性、啟動(dòng)子區(qū)-579G＞T(外顯子1B為起始點(diǎn))單核苷酸多態(tài)性以及啟動(dòng)子區(qū)-149C＞T單核苷酸多態(tài)性(C46359T，GenBank 登錄號(hào) AL035071，rs2424913)，其中以DNMT3B-149C＞T多態(tài)性最為常見(jiàn)[5-7]。

近年來(lái)，各研究表明DNMT3B-149C＞T多態(tài)性可能在癌癥發(fā)生中起關(guān)鍵作用。2002年Shen等[8]發(fā)現(xiàn)DNMT3B-149C＞T多態(tài)性與肺癌相關(guān)。隨后DNMT3B-149C＞T多態(tài)性與乳腺癌、結(jié)直腸癌、白血病等多種腫瘤易感性相關(guān)的研究陸續(xù)發(fā)表，但迄今尚未達(dá)成共識(shí)[9-11]。本文旨在利用Meta分析的方法判斷DNMT3B-149C＞T多態(tài)性和致癌風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，從而為臨床實(shí)驗(yàn)及檢測(cè)提供理論依據(jù)、為個(gè)體化治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源

通過(guò)聯(lián)機(jī)檢索PubMed、Ovid、Embase、Web of Science、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)、維普中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(kù)及中國(guó)知網(wǎng)中1990年1月1日-2017年10月31日中發(fā)表的探討DNMT3B-149C＞T多態(tài)性(rs2424913C＞T)和致癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性的文獻(xiàn)。英文檢索策略為：(“DNA methyltransferase 3B”O(jiān)R“rs2424913”O(jiān)R“C46359T”)AND(“cancer”O(jiān)R“carcinoma”O(jiān)R“tumor”)；中文檢索為：(“DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B”O(jiān)R“rs2424913”O(jiān)R“C46359T基因多態(tài)性”)AND(“癌”O(jiān)R“瘤”)；未進(jìn)行任何檢索限制。

1.2 文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)

本研究的文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)為：①均為觀察性研究(病例-對(duì)照研究、隊(duì)列研究)，設(shè)置癌癥組與對(duì)照組固定比較；②研究對(duì)象為與致癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的rs2424913C＞T多態(tài)性；③有關(guān)基因型或等位基因頻率的數(shù)據(jù)資料可用于評(píng)估比值比(OR)和95%置信區(qū)間(95%CI)；④有研究開(kāi)展和發(fā)表的年限。

1.3 文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn)

本研究的文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn)為：①采用Newcastle-Ottawa Scale(NOS)文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)量表的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)每篇文獻(xiàn)進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量評(píng)價(jià)，綜合考慮研究設(shè)計(jì)質(zhì)量，排除質(zhì)量過(guò)低的文獻(xiàn)[12]；②系統(tǒng)評(píng)價(jià)、Meta分析和其他綜述類文獻(xiàn)；③動(dòng)物與尸體的研究類文獻(xiàn)。

1.4 數(shù)據(jù)提取

由兩名研究人員(吳雯和李萍)獨(dú)立審查這些文獻(xiàn)以排除不相關(guān)和重疊研究，使用NOS量表提取符合條件的研究數(shù)據(jù)。采用統(tǒng)一的數(shù)據(jù)收集表，用于確保數(shù)據(jù)符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確性。比較數(shù)據(jù)收集結(jié)果，對(duì)任何不一致都進(jìn)行充分討論，以達(dá)成共識(shí)。每項(xiàng)納入研究中提取的信息有：第一作者的姓氏、出版年份、受試者的種族、癌癥類型、病例與對(duì)照的數(shù)量、基因分型方法及文獻(xiàn)評(píng)分。經(jīng)討論后，最終就所有提取的信息達(dá)成了共識(shí)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

計(jì)算每個(gè)研究的整體OR及其相應(yīng)的95%CI，以評(píng)估DNMT3B-149C＞T多態(tài)性與致癌風(fēng)險(xiǎn)(純合子基因型比較CC與TT、雜合子基因型比較CT與TT、顯性遺傳型比較CC+CT與TT)之間的關(guān)系。合并OR的顯著性由Z檢驗(yàn)確定，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

通過(guò)Q檢驗(yàn)和I2值評(píng)價(jià)各研究間異質(zhì)性的大小。當(dāng)I2≥50%或P＜0.10，表明各研究間異質(zhì)性較高，可采用隨機(jī)效應(yīng)模型，反之則采用固定效應(yīng)模型分析[10]。若存在明顯異質(zhì)性，通過(guò)敏感性分析依次排除單個(gè)研究尋找差異來(lái)源，排除異質(zhì)性較大的研究，再次進(jìn)行Meta分析合并效應(yīng)值。

通過(guò)漏斗圖分析，Begg's檢驗(yàn)(等級(jí)相關(guān)性檢驗(yàn))和Egger's檢驗(yàn)(加權(quán)線性回歸檢驗(yàn))以圖形方式評(píng)估發(fā)表偏倚(P＜0.05表示存在顯著發(fā)表偏倚)[13]。使用Review Manager 5.0軟件和STATA version 12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 檢索結(jié)果及納入文獻(xiàn)的質(zhì)量評(píng)價(jià)

本文根據(jù)PRISMA(Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses)聲明編寫了研究選擇過(guò)程的詳細(xì)流程圖(圖1)[14]。根據(jù)檢索策略，共檢索到相關(guān)文獻(xiàn)3 039篇。剔除2 057篇重復(fù)文獻(xiàn)，瀏覽題目和摘要后排除867篇，按納入和排除標(biāo)準(zhǔn)全面評(píng)估，剩余30篇文獻(xiàn)進(jìn)入最終研究，其中23項(xiàng)研究為英文，7項(xiàng)為中文(表1)[1-8，15-36]。納入的30項(xiàng)研究按照NOS量表的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了嚴(yán)格的方法學(xué)質(zhì)量評(píng)價(jià)，結(jié)果均為較高質(zhì)量研究(評(píng)分＞5分)。

被納入的文獻(xiàn)均為觀察性研究(病例-對(duì)照研究、隊(duì)列研究)(表1)，無(wú)隨機(jī)或半隨機(jī)研究，其中5項(xiàng)為肺癌、3項(xiàng)為胃癌、3項(xiàng)為肝癌、3項(xiàng)為乳腺癌、8項(xiàng)為結(jié)直腸癌、8項(xiàng)為其他癌癥類型(白血病、食管癌、宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌及頭頸部位腫瘤)。17項(xiàng)研究為亞洲人種，11項(xiàng)研究為歐美人種，1項(xiàng)為非洲人種，1項(xiàng)為混合人種。有25項(xiàng)研究使用了經(jīng)典的PCRRFLP方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析(表1)。

圖1 研究流程圖

表1 納入研究的特點(diǎn)

2.2 Meta分析結(jié)果

納入的30項(xiàng)研究顯示了DNMT3B-149C＞T多態(tài)性(純合型比較CC與TT、雜合型比較CT與TT、顯性遺傳型比較CC+CT與TT)與致癌風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系，共分析了癌癥病例7 612名和健康對(duì)照9 679名。

2.2.1 CC與TT比較 圖2顯示了純合型比較(CC與TT)的相關(guān)信息。各研究間存在異質(zhì)性(Phet＜0.05，I2=70.0%)，采用隨機(jī)效應(yīng)模型分析，其結(jié)果顯示：OR=0.96，95%CI(0.76，1.21)，P=0.73，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明DNMT3B-149C＞T多態(tài)性純合型對(duì)所統(tǒng)計(jì)癌癥的整體致癌風(fēng)險(xiǎn)影響不大。采用依次逐個(gè)剔除納入研究的方法探討單個(gè)研究對(duì)整體結(jié)果的影響程度，敏感性分析顯示：沒(méi)有單個(gè)研究對(duì)合并的OR值造成顯著變化；整體異質(zhì)性波動(dòng)不大(Phet＜0.05，I2＞66.0%)。以上分析說(shuō)明Meta分析結(jié)果的穩(wěn)定性較好。

按癌癥類型進(jìn)行亞組分析(表2)，在肺癌組[OR=1.51，95%CI(1.08，2.12)，P=0.02；I2=47.0%]有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌及其他癌癥組，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說(shuō)明DNMT3B-149C＞T多態(tài)性純合型對(duì)上述癌癥風(fēng)險(xiǎn)影響不大。按種群進(jìn)行亞組分析(表2)，未能在亞洲和高加索人群中檢測(cè)到DNMT3B-149C＞T多態(tài)性純合型與致癌風(fēng)險(xiǎn)之間存在顯著關(guān)聯(lián)。按研究方法進(jìn)行亞組分析(表2)，表明研究方法不影響DNMT3B-149C＞T多態(tài)性純合型對(duì)致癌風(fēng)險(xiǎn)的作用。

圖2 DNMT3B-149C＞T多態(tài)性(純合型比較CC與TT)與致癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性的森林圖

2.2.2 CT與TT比較 圖3顯示了雜合型比較(CT與TT)的相關(guān)信息。各研究間存在異質(zhì)性(Phet＜0.05，I2=67.0%)，采用隨機(jī)效應(yīng)模型分析，其結(jié)果顯示：OR=1.05，95%CI(0.86，1.28)，P=0.65，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明DNMT3B-149C＞T多態(tài)性雜合型對(duì)所統(tǒng)計(jì)癌癥的整體致癌風(fēng)險(xiǎn)影響不大。采用依次逐個(gè)剔除納入研究的方法探討單個(gè)研究對(duì)整體結(jié)果的影響程度，敏感性分析顯示：沒(méi)有單個(gè)研究對(duì)合并的OR值造成顯著變化；整體異質(zhì)性波動(dòng)不大(Phet＜0.05，I2＞62.0%)。以上分析說(shuō)明Meta分析結(jié)果的穩(wěn)定性較好。

按癌癥類型進(jìn)行亞組分析(表2)，在肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌及其他癌癥組，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說(shuō)明DNMT3B-149C＞T多態(tài)性雜合型對(duì)上述癌癥風(fēng)險(xiǎn)影響不大。按種群進(jìn)行亞組分析(表2)，未能在亞洲和高加索人群中檢測(cè)到DNMT3B-149C＞T多態(tài)性雜合型與致癌風(fēng)險(xiǎn)之間存在顯著關(guān)聯(lián)。按研究方法進(jìn)行亞組分析(表2)，表明研究方法不影響DNMT3B-149C＞T多態(tài)性雜合型對(duì)致癌風(fēng)險(xiǎn)的作用。

圖3 DNMT3B-149C＞T多態(tài)性(雜合型比較CT與TT)與致癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性的森林圖

2.2.3 CC+CT與TT比較 圖4顯示了顯性遺傳型比較(CC+CT與TT)的相關(guān)信息。各研究間存在異質(zhì)性(Phet＜0.05，I2=69.0%)，采用隨機(jī)效應(yīng)模型分析，其結(jié)果顯示：OR=1.00，95%CI(0.82，1.22)，P=0.98，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明DNMT3B-149C＞T多態(tài)性顯性遺傳型對(duì)所統(tǒng)計(jì)癌癥的整體致癌風(fēng)險(xiǎn)影響不大。采用依次逐個(gè)剔除納入研究的方法探討單個(gè)研究對(duì)整體結(jié)果的影響程度，敏感性分析顯示：沒(méi)有單個(gè)研究對(duì)合并的OR值造成顯著變化；整體異質(zhì)性波動(dòng)不大(Phet＜0.05，I2＞66.0%)。以上分析說(shuō)明Meta分析結(jié)果的穩(wěn)定性較好。

按癌癥類型進(jìn)行亞組分析(表2)，在肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌組及其他癌癥組，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說(shuō)明DNMT3B-149C＞T多態(tài)性顯性遺傳型對(duì)上述癌癥風(fēng)險(xiǎn)影響不大。按種群進(jìn)行亞組分析(表2)，在亞洲和高加索人群中的DNMT3B-149C＞T多態(tài)性顯性遺傳型與致癌風(fēng)險(xiǎn)之間不存在顯著關(guān)聯(lián)。按研究方法進(jìn)行亞組分析(表2)，表明研究方法不影響DNMT3B-149C＞T多態(tài)性顯性遺傳型對(duì)致癌風(fēng)險(xiǎn)的作用。

2.3 發(fā)表偏倚

DNMT3B-149C＞T多態(tài)性(純合型比較CC與TT、雜合型比較CT與TT、顯性遺傳型比較CC+CT與TT)與致癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性的漏斗圖見(jiàn)圖5～6，漏斗圖的視覺(jué)檢查未發(fā)現(xiàn)實(shí)質(zhì)性的不對(duì)稱性，而Begg秩相關(guān)法和Egger回歸法均未顯示發(fā)表偏倚(表2)。

圖4 DNMT3B-149C＞T多態(tài)性(顯性遺傳型比較CC+CT與TT)與致癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性的森林圖

圖5 DNMT3B-149C＞T多態(tài)性(純合型比較CC與TT)與致癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性漏斗圖

3 討論

DNA的異常甲基化模式已在多種人類腫瘤中被揭示，腫瘤細(xì)胞中DNA甲基化異常主要表現(xiàn)為特定基因位點(diǎn)的高甲基化和基因組的整體低甲基化，這已成為腫瘤的重要表觀遺傳學(xué)變異特征之一。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族(DNMTs)在維持和催化DNA甲基化過(guò)程中起到重要的作用，哺乳動(dòng)物中DNA甲基化的從頭合成催化過(guò)程主要以DNMT3B為主[30]。Ho等[37]研究表明DNMT3B基因編碼區(qū)甲基化增加與結(jié)直腸腺瘤的發(fā)病幾率呈正相關(guān)OR=1.34；95%CI(1.01，1.79)，由于結(jié)直腸腺瘤是結(jié)直腸癌的癌前病變，這就為早期發(fā)現(xiàn)癌變及腫瘤治療提供了新的方向。Lin等[38]研究表明DNMT1、DNMT3A和DNMT3B三種蛋白在肺癌組織中協(xié)同高表達(dá)，且DNMT3B高表達(dá)與抑癌基因的高甲基化明顯相關(guān)(P=0.012)，提示DNMT3B在肺癌的發(fā)生中起重要作用。DNMT3B基因的高表達(dá)使患癌風(fēng)險(xiǎn)增加，其原因可能是通過(guò)調(diào)節(jié)其他基因的甲基化狀態(tài)來(lái)發(fā)揮作用。

圖6 DNMT3B-149C＞T多態(tài)性與致癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性漏斗圖

表2 DNMT3B-149C＞T多態(tài)性與致癌風(fēng)險(xiǎn)之間相關(guān)性的亞組分析

單核苷酸多態(tài)性(SNPs)主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，它是人類可遺傳的變異中最常見(jiàn)的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上[16，32]。研究表明，基因啟動(dòng)子區(qū)的變異不僅會(huì)影響基因表達(dá)、還會(huì)影響酶的活性，從而增加致癌風(fēng)險(xiǎn)[6-7]。目前已有多篇DNMT3B基因啟動(dòng)子區(qū)C46359T多態(tài)性與肺癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤易感性相關(guān)的研究報(bào)道。2002年Shen等[8]研究顯示在肺癌中，DNMT3B啟動(dòng)子區(qū)-149位SNP位點(diǎn)的C＞T轉(zhuǎn)換使轉(zhuǎn)錄活性增加30%，使mRNA表達(dá)和酶活性增加，認(rèn)為其增加了肺癌的易感性。李淵等[15]研究發(fā)現(xiàn)正常人中CT基因型發(fā)生急性白血病的危險(xiǎn)性是TT基因型的4.669倍，提示DNMT3B-149C＞T多態(tài)性是一種可能的腫瘤預(yù)測(cè)等位基因。

本文采用Meta分析方法，綜合近30年國(guó)內(nèi)外公開(kāi)報(bào)道的研究結(jié)果表明，DNMT3B-149C＞T多態(tài)性與所統(tǒng)計(jì)癌癥的整體致癌風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)，這與已有研究[9-11]報(bào)道的結(jié)果基本一致。這一結(jié)果產(chǎn)生的可能原因?yàn)椋孩侔┌Y是一種復(fù)雜的疾病，受遺傳和環(huán)境因素的雙重影響，DNMT3B-149C＞T多態(tài)性可能不是癌癥風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立誘發(fā)因素；②采取了全面檢索已發(fā)表的研究文獻(xiàn)、使用嚴(yán)格的納入及排除標(biāo)準(zhǔn)、精確的數(shù)據(jù)提取與分析等一系列降低異質(zhì)性的手段后，仍舊存在異質(zhì)性；③不同類型癌癥的發(fā)病機(jī)制不同，DNMT3B-149C＞T多態(tài)性可能只參與部分癌癥的發(fā)生與發(fā)展。

按照不同癌癥類型進(jìn)行亞組分析時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)DNMT3B-149C＞T多態(tài)性純合型與肺癌致病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，且與CC基因型相比，TT基因型增加了患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)。本文未得到DNMT3B-149C＞T多態(tài)性與其他癌癥有關(guān)聯(lián)的結(jié)果，可能是不同類型的癌癥具有不同的起始和進(jìn)展機(jī)制，此多態(tài)性在不同的癌癥類型中作用有所不同，且本文納入的各類癌癥研究文獻(xiàn)數(shù)量有限。分別按種群和研究方法進(jìn)行亞組分析，我們發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性來(lái)源與種群和研究方法均無(wú)關(guān)。鑒于DNMT3B可能在腫瘤發(fā)生過(guò)程中起致癌作用；且在生物學(xué)上，DNMT3B多態(tài)性可能通過(guò)增加啟動(dòng)子活性，來(lái)調(diào)節(jié)某些腫瘤抑制基因中CpG島的重新甲基化[30]。研究這種多態(tài)性，可能有助于我們更好地了解腫瘤的生物學(xué)行為，預(yù)測(cè)腫瘤的遺傳易感性以及選擇適宜的個(gè)體療法。

本次Meta分析也存在著一些局限性：①同種癌癥相關(guān)的文獻(xiàn)數(shù)量較少，可納入的樣本量較小，無(wú)法由小樣本量的研究推及可信的整體結(jié)論，由于樣本量有限和/或種族差異，無(wú)法由個(gè)別研究結(jié)果推出可靠的總體結(jié)論；②不同癌癥具有不同的病理類型，如小細(xì)胞肺癌、肺鱗癌、肺腺癌等，DNMT3B-149C＞T多態(tài)性在不同病理類型發(fā)揮的作用可能有差異；③納入的原始文獻(xiàn)中的研究對(duì)象有關(guān)信息(如飲食習(xí)慣、環(huán)境因素等)無(wú)法提取，因此無(wú)法對(duì)混雜因素進(jìn)行亞組分析；④不同納入文獻(xiàn)的研究者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)處理時(shí)，所依據(jù)的操作標(biāo)準(zhǔn)會(huì)有所不同，也會(huì)造成偏倚。

綜上所述，DNMT3B-149C＞T多態(tài)性可能是肺癌易感性因素；DNMT3B基因啟動(dòng)子區(qū)-149位TT基因型發(fā)生肺癌的危險(xiǎn)性明顯高于CC基因型。由于本次研究存在諸多的局限性，尚待更多高質(zhì)量、大樣本循證醫(yī)學(xué)證據(jù)的出現(xiàn)，來(lái)進(jìn)一步證實(shí)這一結(jié)論。