朱嘉微，胡 簫，王希君，王雅茹，馮 林，肖 汀*

(國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室，癌發(fā)生及預(yù)防分子機理北京市重點實驗室，北京 100021)

目前肺癌仍是世界上癌癥死亡的主要原因，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌的85%。雖然目前針對肺癌的早期篩查手段越來越多，但多數(shù)NSCLC患者(約占75%)在確診時已經(jīng)處于中晚期，其癌組織已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，即使通過手術(shù)切除，患者預(yù)后仍不樂觀[1]。研究顯示，大部分中晚期NSCLC患者的中位生存期為8～12個月[2]。因此，我們需要綜合評估中晚期NSCLC患者的預(yù)后，找到中晚期NSCLC發(fā)生發(fā)展的相關(guān)基因，從而篩選出潛在的預(yù)后評估指標(biāo)。

在過去的十年間，泛素蛋白酶體系統(tǒng)已經(jīng)成為開發(fā)新型抗癌療法的有效藥物靶點[3-5]。泛素蛋白酶體途徑是蛋白質(zhì)水解的主要途徑。泛素級聯(lián)反應(yīng)由一系列酶如E1、E2和E3催化而成，其中E3泛素連接酶負(fù)責(zé)靶蛋白的選擇[6-7]。泛素連接酶復(fù)合物(Skp1-Cullin-F-box，SCF)是由穩(wěn)定亞基Skp1、Cul1、環(huán)指蛋白ROC/Rbx1和可變F-box共4部分組成[8]。S期激酶相關(guān)蛋白1(S-phase kinase-associated protein 1，Skp1)是SCF泛素連接酶復(fù)合體的特異性底物識別亞單位F-box家族的成員之一，在胚胎、宮頸、淋巴細(xì)胞、成骨細(xì)胞等不同類型的細(xì)胞和組織中普遍表達[9]。Skp1可以穩(wěn)定F-box蛋白、增強底物結(jié)合能力[10]、參與細(xì)胞周期調(diào)控[11]，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12]。已有研究證明SCF復(fù)合物在腫瘤的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，并且一些F-box蛋白已被證明是治療人類癌癥的潛在靶點[13]。然而，關(guān)于Skp1在NSCLC中的研究還比較少，其是否可以作為肺癌治療靶點仍待進一步研究。因此，本研究通過檢測Skp1在NSCLC組織和外周血中的蛋白水平，分析其與NSCLC臨床病理指標(biāo)及患者預(yù)后的關(guān)系，為Skp1在臨床上的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

本研究所用組織芯片共包含非小細(xì)胞肺癌及其癌旁組織樣本各86例，其中用于Western blot檢測的NSCLC及其配對的癌旁樣本各34例。本研究用于ELISA實驗的NSCLC血漿樣本39例。上述樣本均來自于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院胸外科2014年7月—2016年10月收治的患者，隨訪時間截止為2018年12月。本研究中ELISA試驗所用健康人血漿樣本共27例，來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院體檢人群。所有樣本均取得研究對象的知情同意。

1.2 主要試劑

Skp1小鼠單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司；β-actin小鼠單克隆抗體購于英國Abcam公司；山羊抗鼠IgG HRP二抗(Western blot)、蛋白提取試劑盒購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司；蛋白定量試劑盒(BCATMprotein Assay Kit)購于Thermo Fisher公司；山羊抗鼠IgG HRP二抗(免疫組化用)、20×DAB顯色試劑盒購于MaxVision公司；封閉用正常山羊血清購于北京索萊寶科技有限公司；10×檸檬酸鹽抗原修復(fù)液(pH=6.0)、蘇木素染料均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；H2O2和氨水購于北京化工廠；Skp1 ELISA試劑盒購于Aviva Systems Biology公司。

1.3 Western blot實驗

取NSCLC組織及相應(yīng)癌旁組織樣本各34例置于蛋白提取液(RIPA裂解液∶蛋白酶抑制劑∶PMSF=100∶1∶1)中，用勻漿器攪碎，使其充分裂解，離心，收集上清蛋白；蛋白濃度測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；蛋白變性、定量后電泳(80 V，30 min；120 V，溴酚藍指示)；轉(zhuǎn)膜(250 mA，120 min)；封閉(3%脫脂牛奶，2 h)；孵育一抗(Skp1小鼠單克隆抗體，1∶200稀釋；β-actin小鼠單克隆抗體，1∶4 000稀釋)作用2 h；洗脫，孵育二抗(山羊抗鼠，1∶5 000)作用1 h；曝光成像。

1.4 免疫組化實驗及結(jié)果判定

將86例NSCLC組織及相應(yīng)癌旁組織芯片置于烤箱中，65℃、烘烤5 h；組織芯片經(jīng)脫臘、水化后置于3%H2O2溶液中，室溫、避光孵育10 min以去除細(xì)胞內(nèi)源性過氧化物酶的活性；后經(jīng)1×檸檬酸鹽進行抗原修復(fù)，正常山羊血清室溫封閉15 min，棄去封閉液，用一抗工作液(Skp1小鼠單克隆抗體，1∶100稀釋)4℃孵育過夜；之后，二抗室溫孵育20 min；DAB顯色，在顯微鏡下觀察染色強度；蘇木素染色；脫水；中性樹脂封片，顯微鏡下掃描觀察。

結(jié)果判定：免疫組化染色結(jié)果由兩位臨床病理醫(yī)師獨立判讀，根據(jù)細(xì)胞染色強度和陽性細(xì)胞所占比例進行綜合分析。其中細(xì)胞染色強度的評分標(biāo)準(zhǔn)為：0分(無黃棕色顆粒)，1分(淡黃色顆粒)，2分(棕黃色顆粒)，3分(褐色顆粒)；陽性細(xì)胞比例的評分標(biāo)準(zhǔn)為：0分(陽性細(xì)胞比例≤5%)，1分(5%＜陽性細(xì)胞比例≤25%)，2分(25%＜陽性細(xì)胞比例≤50%)，3分(50%＜陽性細(xì)胞比例≤75%)，4分(75%＜陽性細(xì)胞比例≤100%)。結(jié)果取兩者之積，分4個等級：0分記為(-)，1～4分記為(+)，5～8分記為(++)，9～12分記為(+++)[14]。最終將(-)和(+)定為蛋白低表達，將(++)和(+++)定為蛋白高表達。

1.5 ELISA方法

按照Skp1 ELISA試劑盒說明書來操作，包括梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品；加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔、空白孔，依次加入100μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白、血漿樣品、標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋液；37℃孵育1 h；棄去液體；每孔加入100μL Biotinylated Skp1 Detector Antibody工作液，37℃孵育1 h；棄去液體，每孔加入300μL洗滌液洗滌，重復(fù)3次；每孔加入100μL Avidin-HRP結(jié)合工作液，37℃孵育30 min；棄去孔內(nèi)液體，洗滌液洗板5次；每孔加底物溶液90μL，37℃避光顯色30 min；每孔加入終止液50μL，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測各孔的D(450)值。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用Image J 1.8.0圖像軟件進行Western blot條帶灰度值處理；采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 7.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。本研究中，患者的預(yù)后(disease-free survival，DFS)隨訪期為患者首次手術(shù)日期至發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或隨訪結(jié)束日期，用月計算。分別采用卡方檢驗和非配對T檢驗分析肺癌組織和外周血中Skp1的表達與各臨床指標(biāo)之間的關(guān)系；采用Kaplan-Meier方法繪制肺癌患者的生存曲線，并進行Log-rank檢驗；采用多因素Cox回歸分析研究風(fēng)險因素。以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測Skp1蛋白在NSCLC組織中的表達

Western blot檢測34例NSCLC組織及相應(yīng)癌旁組織樣本中Skp1蛋白的表達水平如圖1A所示，結(jié)果顯示Skp1蛋白在NSCLC組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)，見圖1B。

圖1 Western blot檢測Skp1蛋白在NSCLC組織和癌旁組織中的表達

2.2 免疫組化法檢測Skp1蛋白在NSCLC組織中的表達

免疫組化法檢測86例NSCLC組織及癌旁組織樣本中Skp1蛋白的表達水平，結(jié)果顯示Skp1陽性表達主要定位于NSCLC細(xì)胞的細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒彌漫分布在細(xì)胞漿中(圖2)。Skp1蛋白在NSCLC組織中呈陽性高表達，陽性表達率為47.7%(41/86)，Skp1蛋白在癌旁組織中低表達，陽性表達率為10.5%(9/86)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。Skp1蛋白在NSCLC組織中的表達與腫瘤的臨床分期、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度等因素?zé)o顯著相關(guān)關(guān)系(P＞0.05)，見表1。

圖2 免疫組織化學(xué)染色檢測Skp1蛋白在NSCLC組織及癌旁組織中的表達

表1 NSCLC組織中Skp1蛋白的表達水平與臨床指標(biāo)之間的關(guān)系

2.3 ELISA檢測Skp1蛋白在NSCLC患者血漿中的表達水平

ELISA檢測Skp1在39例NSCLC患者血漿及27例健康人血漿中的蛋白水平，結(jié)果顯示Skp1在NSCLC患者血漿中的蛋白濃度顯著高于健康人群(P=0.003)(圖3)。以所有受試人群外周血中Skp1蛋白濃度的中位數(shù)(90.65 pg/mL)為臨界點，將受試人群分為兩組，分別為：Skp1低水平組(＜90.65 pg/mL)和Skp1高水平組(≥90.65 pg/mL)。統(tǒng)計學(xué)分析顯示Skp1蛋白在非小細(xì)胞肺癌外周血中的表達水平與腫瘤的臨床分期、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度等因素?zé)o顯著相關(guān)關(guān)系(P＞0.05)。Skp1蛋白在NSCLC患者外周血中的表達水平與各臨床參數(shù)之間的關(guān)系見表2。

圖3 ELISA檢測Skp1蛋白在NSCLC患者血漿中的表達水平

表2 NSCLC患者外周血中Skp1蛋白的表達水平與臨床指標(biāo)之間的關(guān)系

2.4 Skp1蛋白在NSCLC組織中的表達與患者預(yù)后的關(guān)系

本研究中共79例NSCLC患者有相應(yīng)的預(yù)后信息(復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及生存情況)，其中包含35例早期(I)患者，44例中晚期(II+III)患者；37例低分化患者，42例高中分化患者。隨訪時間3～54個月，中位隨訪時間34個月。用Kaplan-Meier預(yù)后分析表明，在早期(I)NSCLC患者中，Skp1蛋白高表達和低表達患者間預(yù)后差異不顯著(P=0.140，圖4A)，而在中晚期(II+III)患者中，Skp1蛋白高表達的NSCLC患者預(yù)后顯著差于Skp1低表達的患者(P=0.001，圖4B)。在分化程度比較低的NSCLC患者中，Skp1蛋白高表達的NSCLC患者的預(yù)后顯著差于Skp1低表達的患者(P=0.004，圖4C)。而在分化程度比較高的NSCLC患者中，則差異不顯著(P=0.699，圖4D)。多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，Skp1蛋白可以作為判斷中晚期(II+III)NSCLC患者預(yù)后的獨立危險因素(P=0.006，表3)。

圖4 Kaplan-Meier生存分析組織中Skp1蛋白表達水平與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系(n=79)

3 討論

非小細(xì)胞肺癌是一種高發(fā)病率、高致死率的惡性腫瘤。尤其處于中晚期的肺癌患者，即使通過手術(shù)切除，患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、死亡的幾率依舊很高。因此，我們需要進一步找到中晚期NSCLC發(fā)生發(fā)展的相關(guān)基因，從而篩選出潛在的預(yù)后指標(biāo)，為臨床評估提供一定的理論依據(jù)。

近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，SCF泛素連接酶復(fù)合體(Skp1-Cullin-F-box)可以通過泛素依賴的蛋白水解途徑降解細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，參與細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)控，進而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[15]。Yu等[16]研究發(fā)現(xiàn)Skp1/Skp2/Cul1復(fù)合體可以選擇性的靶向p21和cyclin D蛋白，并進行泛素化降解，該復(fù)合體的異常表達可能會調(diào)控G1期細(xì)胞周期調(diào)控因子的蛋白表達水平，進而參與腫瘤的形成過程。Hussain等[5]在肺癌中的研究結(jié)果表明干擾Skp1基因的表達能明顯抑制肺癌細(xì)胞的生長、增殖、克隆活性和G2/M期阻滯，表明Skp1與肺癌發(fā)生發(fā)展和患者生存密切相關(guān)。此外，將Skp1從F-box中分離出來會引起F-box相關(guān)蛋白(ALK/NIPA、Skp2和TRCP)的降解，進一步表明Skp1表達水平的升高可能會促進SCF連接酶的致癌活性。Cul1在黑色素瘤、乳腺癌和肺癌中高表達，促進癌細(xì)胞的增殖，并且Cul1的高表達與腫瘤患者的不良預(yù)后有關(guān)[17-18]。含β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素重復(fù)的E3泛素蛋白連接酶(betatransducin repeat containing E3 ubiquitin protein ligase，β-TRCP)通過介導(dǎo)泛素化途徑降解IkBα從而激活核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)，增強β-catenin轉(zhuǎn)錄活性[19]。大量研究發(fā)現(xiàn)Skp2基因與肺癌的侵襲、浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后顯著相關(guān)。Wang等[20]在黑色素瘤細(xì)胞中的研究顯示Skp2能通過介導(dǎo)MutT同源物1(MutT homolog 1，MTH1)的穩(wěn)定性，抑制氧化應(yīng)激引起的DNA損傷和細(xì)胞凋亡，進而促進黑色素瘤細(xì)胞的生存。Takanami等[21]用RT-PCR和免疫組織化學(xué)染色方法研究了79例NSCLC組織標(biāo)本Skp2的表達水平與臨床參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Skp2與病理分期、組織學(xué)亞型、血管侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素顯著相關(guān)，并且Skp2高表達的NSCLC患者生存率顯著偏低。此外，多因素COX分析表明Skp2是肺癌患者預(yù)后的獨立危險因素，提示其可作為NSCLC侵襲性強和不良預(yù)后的潛在指標(biāo)。Zhang[22]和Ding等[23-24]研究發(fā)現(xiàn)Skp2是骨肉瘤的一個潛在治療靶點，Skp2在骨肉瘤細(xì)胞中高表達，并且其高表達與骨肉瘤患者的不良預(yù)后有關(guān)，干擾Skp2基因表達能夠減少骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，降低體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移。Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)致癌性E3連接酶通過降解腫瘤抑制因子使細(xì)胞無限增殖、基因組不穩(wěn)定，從而發(fā)生細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。

表3 多因素Cox回歸分析臨床指標(biāo)和Skp1蛋白表達水平與中晚期(II+III)NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系

越來越多的實驗和研究證明，在人類多種癌癥中，SCF復(fù)合物，包括核心組分(Cul1和Rbx1)和受體組分(Skp2和β-TRCP等)的差異過表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和患者不良預(yù)后密切相關(guān)[25-27]。然而，關(guān)于Skp1在NSCLC中的研究還比較少，其是否和SCF其他組分一樣與肺癌患者預(yù)后相關(guān)，以及是否可以作為肺癌治療靶點仍有待研究。因此，本研究通過檢測Skp1在NSCLC組織和外周血中的蛋白表達水平，分析探索其與NSCLC臨床病理指標(biāo)及患者預(yù)后的關(guān)系，為Skp1在臨床上的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。我們本次的研究發(fā)現(xiàn)Skp1也有類似的現(xiàn)象，本研究通過Western blot、免疫組化和ELISA分別檢測了Skp1在NSCLC和正常人組織及外周血中Skp1蛋白的表達水平，發(fā)現(xiàn)Skp1蛋白在NSCLC中顯著高表達(P＜0.01)。Kaplan-Meier單因素生存分析顯示，在中晚期(II+III)NSCLC患者以及低分化NSCLC患者中，Skp1蛋白高表達的NSCLC患者的預(yù)后均顯著差于Skp1低表達的患者(P＜0.01)，多因素Cox回歸分析顯示Skp1蛋白可以作為判斷中晚期(II+III)NSCLC患者預(yù)后的獨立危險因素(P＜0.01)。這提示著Skp1基因可能作為癌基因參與到NSCLC的進程，并且NSCLC惡性程度越高Skp1影響越顯著。雖然研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Skp1在NSCLC患者中異常表達，并且可能作為癌基因參與NSCLC發(fā)生發(fā)展的進程，但仍有很多生物學(xué)功能方面的問題需要解答：Skp1是通過什么信號傳導(dǎo)機制結(jié)合到F-box蛋白上，其異常表達又是如何影響SCF復(fù)合體的致癌性；Skp1在機體又是受什么信號誘導(dǎo)發(fā)生異常表達，進而參與癌癥進程等，有待進一步的細(xì)胞功能學(xué)實驗驗證和研究。相較于其他分子而言，目前對于Skp1的研究卻很少，值得我們進一步探索。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Skp1蛋白在NSCLC患者組織和外周血中顯著高表達，并且其在NSCLC組織中的高表達與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)，是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵分子，這提示Skp1蛋白有望成為中晚期(II+III)NSCLC患者診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物和治療靶點。