張艷華 王德普 孫家棟 王 洋 宋 祺 張朝立 高長久

（牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011）

雞樹條果（Fruit of Sargent Viburnum），又名莢蒾果，始載于《吉林中草藥》，為忍冬科莢蒾屬植物雞樹條莢蒾Viburnum opulus Linn.var.calvescens（Rehd.）Hara的果實［1］，民間常用于急（慢）性氣管炎、咳嗽等病癥?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，其主要有黃酮類、酚類、微量元素、揮發(fā)油、多糖、氨基酸、有機(jī)酸、香豆素類及其苷類等化學(xué)成分［2］。本課題采用水和乙醇兩種溶劑分別對雞樹條果進(jìn)行提取，并對其水提物和醇提物的抗炎、祛痰和鎮(zhèn)咳活性進(jìn)行考察，為進(jìn)一步分析其抗炎、祛痰和鎮(zhèn)咳有效部位奠定基礎(chǔ)，為拓展其臨床范圍和合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物 健康昆明種小鼠，清潔級，體質(zhì)量為（20±2）g，雌雄兼用。由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（黑）2013-001。實驗前在本實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，室溫 19～24℃，相對濕度45%～68%。本實驗在嚴(yán)格按照動物保護(hù)規(guī)定下進(jìn)行。

1.2 實驗藥品與試劑 雞樹條果藥材，采自黑龍江牡丹峰國家級自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源與開發(fā)教研室王振月教授鑒定為忍冬科莢蒾屬植物雞樹條莢蒾，將采摘的新鮮雞樹條果在背光通風(fēng)條件下陰干，即得干品；吲哚美辛，批號：170725，廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供；麻杏止咳片，批號：20170613，吉林雙藥藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供。伊文思藍(lán)，批號：170621，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司提供；二甲苯，批號：170819，哈爾濱市化工試劑廠提供；冰醋酸，批號：20170822，天津市永大化學(xué)試劑有限公司提供；75%乙醇，批號：20170817，成都市科龍化工試劑廠提供；苯酚紅，批號：20170716，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供；碳酸氫鈉，批號：20170813，天津博迪化工股份有限公司提供；氯化鈉注射液，批號：S17082612-2，吉林康乃爾藥業(yè)有限公司提供；氨水，批號：20170913，沈陽市新東試劑廠提供。

1.3 實驗儀器 電子天平，型號T1000，常熟市雙杰測試儀器廠提供；分析天平，型號 AX200，SHIMADZU CORPORATION JAPAN提供；紫外-可見分光光度計，型號752N，上海精密科學(xué)儀器有限公司提供；離心機(jī)，型號TDL-80-2B，上海安亭科學(xué)儀器廠提供。多功能誘咳引喘儀，型號YLS-8A，濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司提供；高速粉碎機(jī)，型號WK-600A，貴州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司提供；可調(diào)控溫電熱套，型號ZDHW，北京中興偉業(yè)儀器有限公司提供。

2 實驗方法

2.1 雞樹條果2種提取物的制備

2.1.1 水提物的制備 雞樹條果藥材用粉碎機(jī)粉碎成粉末狀，將粉末加10倍量蒸餾水浸泡1 h，回流提取3次，1 h/次，抽濾，合并濾液，離心取上清液，濃縮所得浸膏，即雞樹條果水提物，將浸膏加蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH值為7.2，放入冰箱中3～4℃冷藏備用。

2.1.2 醇提物的制備 將藥材雞樹條果粉碎過篩，粉末加75%乙醇70℃下回流提取 3次，1 h/次，抽濾，合并濾液，離心取上清液，濃縮所得浸膏，即雞樹條果醇提物，將醇提物用無水乙醇溶解，蒸餾水稀釋，調(diào)節(jié)pH值為7.2，放入冰箱中3～4℃冷藏備用。

2.2 劑量設(shè)定 通過預(yù)實驗，確定雞樹條果兩種提取物抗炎、祛痰和鎮(zhèn)咳實驗的最低有效劑量均為 3.2 g/kg（生藥/體重），設(shè)定中、高劑量組給藥劑量分別為6.4，12.8 g/kg（生藥/體重）。

2.3 小鼠耳腫脹實驗 取80只小鼠隨機(jī)分為8組，即雞樹條果水提物高、中、低劑量組，雞樹條果醇提物高、中、低劑量組，生理鹽水組，吲哚美辛組，每組10只。雞樹條果水和醇提物高、中、低劑量組的灌胃給藥劑量分別為 12.8，6.4，3.2 g/kg（生藥/體重），吲哚美辛組給藥劑量為0.0094 g/kg，空白對照組灌胃給予等體積的生理鹽水。每天按0.2 mL/10 g灌胃給藥1次，連續(xù)7 d。于末次給藥1 h后，將0.05 mL二甲苯均勻的涂抹于各組小鼠右耳的兩面，小鼠的左耳不涂作為對照，致炎0.5 h后，脫頸椎處死，沿著小鼠耳廓剪下小鼠的兩耳，用直徑為6 mm的打孔器，在兩耳相同位置打下耳片，分別稱重，記錄小鼠左右耳片重量，按下述公式計算腫脹度與腫脹抑制率［3-6］。

腫脹度=腫脹耳（右耳）重量-對照耳（左耳）重量腫脹抑制率（%）=（對照組平均腫脹率-給藥組平均腫脹率）/對照組平均腫脹率×100%。

2.4 小鼠腹腔滲透實驗 實驗分組、給藥方法如同“2.3”，末次給藥1 h后，經(jīng)小鼠尾靜脈注射 0.5%伊文思藍(lán)生理鹽水溶液10 mL/kg，10 min后腹腔注射0.6%冰醋酸10 mL/kg，15 min后脫頸椎處死小鼠，腹腔注射生理鹽水6 mL，輕揉腹部3 min，從腹腔中取腹腔沖洗液3 mL（如有血液污染，棄去不用），2000 r/min離心10 min（r=8 cm），取上清液用紫外-可見分光光度計于波長590 nm處測定吸光度 （A） 值［3-6］。

2.5 小鼠祛痰實驗 除陽性對照組更換為麻杏止咳片組（0.8 g/kg）外，實驗分組、給藥方法均同“2.3”，末次給藥0.5 h后，腹腔注射0.5%酚紅 20 mL/kg，0.5 h后脫頸椎處死小鼠，仰臥位固定于蛙板上并分離氣管，剝離氣管周圍組織，剪下自甲狀軟骨下至氣管分支處的一段氣管，放入盛有2 mL生理鹽水的試管中，再加0.1 mL 5%NaHCO3溶液，1000 r/min離心0.5 h，取上清液，用可見分光光度計于波長546 nm處測吸光度（A）值［7-9］。2.6小鼠鎮(zhèn)咳實驗 實驗分組、給藥方法同“2.5”。連續(xù)給藥7 d，于末次給藥0.5 h后將小鼠置于誘咳引喘儀中，設(shè)定氨水誘咳時間為30 s，測定時間為5 min，觀察并記錄此過程中小鼠咳嗽潛伏期（從誘咳至發(fā)生首次咳嗽的時間）和小鼠在5 min內(nèi)咳嗽的次數(shù)（小鼠腹肌收縮或縮胸，并張大嘴，頭向前傾，有時帶有咳嗽聲）［7-9］。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 各組實驗數(shù)據(jù)結(jié)果以（x±s）表示，采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行方差檢驗，組間比較用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對小鼠一般特征的影響 各實驗組小鼠生活狀態(tài)與實驗前均無明顯差別，無精神萎靡或死亡，飲食量與飲水量基本穩(wěn)定，各組體重增長速度無明顯差異。

3.2 雞樹條果對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 與生理鹽水組比較，雞樹條果水提物中劑量組（P＜0.05）、高劑量組（P＜0.01）、雞樹條果醇提物高劑量組 （P＜0.05） 及吲哚美辛組（P＜0.01）均有統(tǒng)計學(xué)意義，對二甲苯所致的耳腫脹均有明顯的抑制作用，表明雞樹條果水、醇提取物均有抗炎作用，且水提物抗炎作用優(yōu)于醇提物。見表1。

表1 雞樹條果對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 （±s，n=10）

表1 雞樹條果對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 （±s，n=10）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量（g/kg）生理鹽水組吲哚美辛組雞樹條果水提物低劑量組雞樹條果水提物中劑量組雞樹條果水提物高劑量組雞樹條果醇提物低劑量組雞樹條果醇提物中劑量組雞樹條果醇提物高劑量組腫脹度（mg） 腫脹抑制率（%）--71.10 10.82 36.19 65.26 6.90 13.09 45.00 0.009 4 3.2 6.4 12.8 3.2 6.4 12.8 22.91±2.67 6.62±1.46**20.43±3.01 14.62±1.84*7.96±2.33**21.33±1.12 19.91±2.13 12.60±1.84*

3.3 雞樹條果對冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響 與生理鹽水組比較，雞樹條果水提物中劑量組（P＜0.01）、高劑量組（P＜0.01）、雞樹條果醇提物中劑量組（P＜0.05）、高劑量組 （P＜0.01） 及吲哚美辛組 （P＜0.01）均有統(tǒng)計學(xué)意義，對冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性均有明顯的抑制作用，表明雞樹條果水、醇提取物均有抗炎作用，且水提物抗炎作用優(yōu)于醇提物。見表2。

表2 雞樹條果對冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響（±s，n=10）

表2 雞樹條果對冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響（±s，n=10）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量（g/kg）生理鹽水組吲哚美辛組雞樹條果水提物低劑量組雞樹條果水提物中劑量組雞樹條果水提物高劑量組雞樹條果醇提物低劑量組雞樹條果醇提物中劑量組雞樹條果醇提物高劑量組-0.009 4 3.2 6.4 12.8 3.2 6.4 12.8光吸收值(A)0.30±0.06 0.07±0.03**0.21±0.08 0.09±0.04**0.08±0.04**0.23±0.08 0.16±0.04*0.09±0.04**

3.4 雞樹條果對小鼠氣管酚紅排泌量的影響 與生理鹽水組比較，雞樹條果水提物中劑量組（P＜0.05）、高劑量組（P＜0.01）、雞樹條果醇提物中劑量組（P＜0.05）、高劑量組 （P＜0.01） 及麻杏止咳片組 （P＜0.01） 均有統(tǒng)計學(xué)意義，對均能明顯增加小鼠氣管酚紅的排泌量，表明雞樹條果水、醇提取物均有祛痰作用，且兩種提取物祛痰作用相當(dāng)，無明顯差異。見表3。

表3 雞樹條果對小鼠氣管酚紅排泌量的影響 （±s，n=10）

表3 雞樹條果對小鼠氣管酚紅排泌量的影響 （±s，n=10）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

光吸收值(A)0.06±0.03 0.16±0.06**0.08±0.05 0.11±0.05*0.15±0.06**0.08±0.06 0.10±0.06*0.14±0.05**組別 劑量（g/kg）生理鹽水組麻杏止咳片組雞樹條果水提物低劑量組雞樹條果水提物中劑量組雞樹條果水提物高劑量組雞樹條果醇提物低劑量組雞樹條果醇提物中劑量組雞樹條果醇提物高劑量組－0.8 3.2 6.4 12.8 3.2 6.4 12.8

3.5 雞樹條果對濃氨水致小鼠咳嗽的影響 與生理鹽水組比較，雞樹條果水提物低劑量組（P＜0.05）、中劑量組 （P＜0.01 或 P＜0.05）、高劑量組 （P＜0.01）、雞樹條果醇提物低、中劑量組 （P＜0.05）、高劑量組 （P＜0.01） 及麻杏止咳片組（P＜0.01）均有統(tǒng)計學(xué)意義，對濃氨水致小鼠咳嗽的潛伏期及 5 min內(nèi)咳嗽次數(shù)均有明顯的抑制作用，表明雞樹條果水、醇提取物均有鎮(zhèn)咳作用，且兩種提取物鎮(zhèn)咳作用相當(dāng)，無明顯差異。見表4。

表4 雞樹條果對濃氨水致小鼠咳嗽的影響 （±s，n=10）

表4 雞樹條果對濃氨水致小鼠咳嗽的影響 （±s，n=10）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量（g/kg）生理鹽水組麻杏止咳片組雞樹條果水提物低劑量組雞樹條果水提物中劑量組雞樹條果水提物高劑量組雞樹條果醇提物低劑量組雞樹條果醇提物中劑量組雞樹條果醇提物高劑量組潛伏期(s) 咳嗽次數(shù)(n)-0.8 3.2 6.4 12.8 3.2 6.4 12.8 21.5±1.23 47.1±1.40**32.7±1.22*35.6±1.23*42.9±1.42**33.5±1.19*36.7±1.20*43.6±1.38**65.1±1.46 17.6±0.87**57.9±1.21 36.4±1.28**29.1±1.23**58.5±1.24 45.0±1.31*29.7±1.16**

4 討論

雞樹條果藥材原植物雞樹條莢蒾主產(chǎn)于東北、華北及陜西、甘肅等地，山東、安徽、浙江、江西、河南、湖北、四川等地亦有分布。其中黑龍江地區(qū)雞樹條莢蒾野生分布廣、栽培區(qū)域大，儲量巨大，為雞樹條果在中藥領(lǐng)域的研發(fā)與應(yīng)用提供了深厚的資源基礎(chǔ)［10］。其枝、葉（雞樹條）藥理作用顯著，尤其是在解痙、止血、抗膽堿酯酶、血管保護(hù)等方面，其果實同樣具有極強(qiáng)的藥用開發(fā)價值。

小鼠耳腫脹實驗提示雞樹條果水和醇兩種提取物高、中劑量組均可抑制由二甲苯致炎劑引起的某些炎癥介質(zhì)（如組胺、激肽、纖維蛋白溶解酶等）的釋放，降低局部毛細(xì)血管擴(kuò)張和通透性增加及炎癥細(xì)胞浸潤，從而減輕耳部急性滲出性炎性水腫；小鼠腹腔滲透實驗提示雞樹條果兩種提取物高、中劑量均可降低因腹腔注射冰醋酸溶液中H+作用下引起的腹腔毛細(xì)血管通透性增高，減少血液液體成分（如伊文思藍(lán)與血漿蛋白結(jié)合物等）從血管內(nèi)向腹腔滲出，從而對急性炎癥產(chǎn)生抑制作用；小鼠鎮(zhèn)咳實驗提示雞樹條果兩種提取物高、中劑量均能抑制呼吸中樞或降低呼吸道感受器敏感性，減輕由化學(xué)物質(zhì)濃氨水刺激呼吸道感受器所引起的反射性咳嗽，從而達(dá)到鎮(zhèn)咳效果；小鼠祛痰實驗提示雞樹條果兩種提取物高、中劑量均能使呼吸道粘膜粘液腺排出的酚紅量增加，說明支氣管粘膜分泌液增加，從而達(dá)到祛痰效果。

本項目從藥效學(xué)角度研究表明，雞樹條果水和醇兩種提物高、中劑量組在抗炎、祛痰、鎮(zhèn)咳作用方面均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01或P<0.05），且存在著一定的量效關(guān)系。水提物抗炎作用較好，推測其與發(fā)揮抗炎作用的有效成分水溶性較好有關(guān)。同時，本課題組對雞樹條果中發(fā)揮抗炎、祛痰、鎮(zhèn)咳作用的有效成分及其具體作用機(jī)制正在進(jìn)一步研究中。