，，，，*

(1.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，武漢 430023；3.武漢食品化妝品檢驗(yàn)所，武漢 430012)

香辛料是人們常用的一系列食品調(diào)味品，具有調(diào)和滋味、增進(jìn)食欲、延長(zhǎng)食品保質(zhì)期等功效[1-3]，是日常食品烹調(diào)中不可缺少的一部分。近年來(lái)有研究表明，香辛料提取物具有良好的抗氧化活性[4-8]，相關(guān)研究也在不斷進(jìn)行中。隨著人們對(duì)健康生活和食品品質(zhì)的要求逐漸提高，人們開(kāi)始考慮食品中添加的合成抗氧化劑對(duì)人體產(chǎn)生的不良影響，天然抗氧化劑已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。香辛料是重要的天然抗氧化劑的來(lái)源，本實(shí)驗(yàn)對(duì)14種香辛料的水提物、醇提物的抗氧化能力及與多酚、黃酮含量的相關(guān)性進(jìn)行了研究，為香辛料天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)和研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

14種香辛料辣椒、花椒、桂皮、白芷、豆蔻、沙姜、草果、八角茴香、丁香、黑胡椒、香葉、甘草、陳皮、茴香：均購(gòu)于武漢舵落口香料市場(chǎng)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：購(gòu)自上海TCI公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(rutin)、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(gallic acid)：購(gòu)自上海源葉生物公司；無(wú)水乙醇、鄰苯三酚、Vc、亞硝酸鈉、三氯化鋁、氫氧化鈉、福林酚、碳酸鈉：均為國(guó)產(chǎn)分析純；水：超純水，實(shí)驗(yàn)室制備。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SB-5200DTN超聲波清洗器，SCIENT2-12N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；A360紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 翱藝儀器(上海)有限公司；AR2140電子分析天平 奧斯特儀器有限公司；TG18M高速離心機(jī) 長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 香辛料提取物的制備

14種香辛料烘干后粉碎，過(guò)40目篩。準(zhǔn)確稱量50 g原材料，按 1∶10 (m/V)的料液比，使用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液于50 ℃超聲提取45 min，經(jīng)80 ℃水浴回流提取3次，每次1 h；合并濾液，減壓濃縮至浸膏狀，冷凍干燥，得香辛料醇提取物，測(cè)試前使用70%的乙醇進(jìn)行配制。準(zhǔn)確稱取香辛料粉末50 g，按1∶10 (m/V)的料液比，使用超純水于50 ℃超聲提取45 min，經(jīng)80 ℃水浴回流提取3次，每次1 h；合并濾液，減壓濃縮至浸膏狀，冷凍干燥，得香辛料水提取物，測(cè)試前使用超純水進(jìn)行配制。

1.2.2 黃酮與多酚含量的測(cè)定

黃酮含量的測(cè)定：采用AlCl3-乙酸鉀比色法[9]，稍作修改。配制梯度濃度為0.02，0.04，0.06，0.08，0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。取2 mL待測(cè)液與0.3 mL 5%的亞硝酸鈉溶液混合，6 min之后加入0.3 mL 10%的三氯化鋁溶液，充分混勻反應(yīng)5 min之后加入2 mL 1 mol/L的氫氧化鈉溶液，待反應(yīng)液充分混勻，15 min后于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定不同濃度梯度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將提取物配制成濃度為0.4 mg/mL的待測(cè)液，按上述步驟測(cè)量吸光度，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃酮含量。結(jié)果以每克提取物中含有的相當(dāng)量蘆丁毫克數(shù)來(lái)表示(mg/g)。

多酚含量的測(cè)定：采用福林-酚法[10]，稍作修改。配制梯度濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。取0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液與0.4 mL福林酚試劑與7.5 mL水充分混勻，5 min之后加入10%的碳酸鈉溶液1.6 mL，待反應(yīng)液充分混勻后于室溫下避光反應(yīng)2 h，于765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將提取物配制成0.4 mg/mL的待測(cè)液按上述步驟測(cè)量吸光度，根據(jù)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃酮含量。結(jié)果以每克提取物中含有的相當(dāng)量沒(méi)食子酸毫克數(shù)來(lái)表示(mg/g)。

1.2.3 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考Adekoya等[11]的方法，稍作修改，配制為20，40，60，80，100 μg/mL的香辛料提取物待測(cè)液以及VC待測(cè)液。取2 mL待測(cè)液與2 mL 1×10-3mol/L的DPPH充分混合，室溫下避光靜置30 min后于517 nm處測(cè)定其吸光度。待測(cè)液對(duì)DPPH自由基的清除率按公式(1)計(jì)算：

DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100。

(1)

式中：Ai為樣品混合DPPH后的吸光度；Aj為樣品與等體積溶劑混合后的吸光度；A0為DPPH與等體積溶劑混合后的吸光度。

1.2.4 超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法[12]，稍作修改。配制濃度梯度為1，2，3，4，5 mg/mL的香辛料待測(cè)液與VC待測(cè)液，取待測(cè)液1 mL于10 mL試管中，加入pH值為8.2的Tris-HCl緩沖溶液8.7 mL，隨后加入0.3 mL 3 mmol/L的鄰苯三酚溶液，迅速混勻后用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定 322 nm波長(zhǎng)處的吸光度(以10 mmol/L的鹽酸做參比溶液)。每隔1 min測(cè)1次，直到反應(yīng)啟動(dòng)后第9 min將所得的數(shù)據(jù)以時(shí)間為橫坐標(biāo)、A322值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到的直線斜率為反應(yīng)速率V0，Vi。清除率按公式(2)計(jì)算：

K(%)=(1-Vi/V0)×100。

(2)

式中：Vi為不加待測(cè)液時(shí)的反應(yīng)速率；V0為加入待測(cè)液時(shí)的反應(yīng)速率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Microsoft Excel 2007、SPSS 4.0軟件進(jìn)行，數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 香辛料提取物得率

14種香辛料所得的28種提取物得率見(jiàn)表1，同種香辛料的醇提物和水提物的提取率基本相當(dāng)，辣椒、桂皮水提物和醇提物的提取率差異顯著(P<0.01)。14種香辛料的提取率均在2.7%以上。

表1 14種香辛料水提物與醇提物的提取率Table 1 The extraction rates of 14 spices' aqueous extracts and alcohol extracts %

2.2 香辛料提取物中多酚、黃酮的含量

實(shí)驗(yàn)得多酚線性回歸方程為：y=0.3395x-0.001(R2=0.9995)，黃酮線性回歸方程為：y=1.333x+0.0223(R2=0.9991)。

14種香辛料水提物與醇提物的多酚和黃酮含量見(jiàn)表2。

注：同一列中上標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)，下同。

由表2可知，28種香辛料提取物中，同種香辛料的醇提物和水提物間多酚、黃酮含量差異顯著(P<0.05)。香辛料醇提物多酚和黃酮含量整體高于香辛料水提物，其中醇提物中黃酮含量明顯高于水提物。丁香水提物中黃酮含量為(49.70±1.28) mg/g，而醇提物中含量為(97.65±1.91) mg/g，差異具有顯著性(P<0.01)。丁香、桂皮、花椒、香葉、草果5種香辛料的水提物、醇提物的多酚、黃酮含量均較高，其中多酚含量在21.83 mg/g，黃酮含量在24.81 mg/g以上，與郭艷華等的研究結(jié)果相同。

2.3 香辛料抗氧化能力比較[13]

2.3.1 香辛料提取物DPPH自由基清除率以及量效關(guān)系

由圖1和圖2可知，香辛料提取物的DPPH自由基清除率隨提取液濃度升高而逐漸提高，但清除效果大多低于陽(yáng)性對(duì)照Vc。在濃度為100 μg/mL時(shí)，丁香、桂皮提取物與Vc的清除率基本相當(dāng)，均大于90%；花椒、香葉、茴香提取物的清除率在85%以上。其中水提物中辣椒提取物的清除率最低，醇提物中山奈提取物的清除率最低。

由表3可知，14種香辛料提取物DPPH自由基清除率IC50值具有顯著差異(P<0.05)，大多數(shù)香辛料水提物的IC50值高于相應(yīng)的醇提物，且均高于Vc。如花椒醇提物的IC50值為(0.03±0.00) mg/mL，而水提物為(0.06±0.00) mg/mL。茴香醇提物的抗氧化能力明顯低于水提物，茴香醇提物的IC50值為(0.07±0.00) mg/mL，水提物的IC50值為(0.19±0.01) mg/mL。DPPH自由基清除率較好的是丁香、桂皮、花椒、香葉、八角提取物，IC50值均低于0.05 mg/mL，具有良好的抗氧化能力。

2.3.2 香辛料提取物超氧陰離子自由基清除率以及量效關(guān)系

圖3 香辛料水提物對(duì)O2-·自由基的清除效果Fig.3 O2-·free radical scavenging rates of spices' aqueous extracts

圖4 香辛料醇提物對(duì)O2-·自由基的清除效果

由圖3和圖4可知，香辛料提取物超氧陰離子自由基的清除率隨提取液濃度升高而逐漸提高，但清除效果大多低于陽(yáng)性對(duì)照Vc。在提取物濃度為1 mg/mL時(shí)，Vc O2-·自由基清除率即達(dá)到64.98%，丁香水提物、醇提物的清除率均達(dá)到53%，在低濃度時(shí)即具有良好的清除率。在樣品濃度為5 mg/mL時(shí)，丁香、黑胡椒、桂皮水提物的清除率均高于94%，與Vc的清除率相當(dāng)，其中陳皮水提物、醇提物的清除率均為最低。

表4 14種香辛料水提物與醇提物超氧陰離子自由基清除率IC50值Table 4 IC50 values of O2-· free radical scavenging rates of 14 spices' aqueous extracts and alcohol extracts mg/mL

由表4可知，香辛料水提物O2-·自由基清除率IC50值總體上略高于醇提物。14種香辛料O2-·自由基清除率IC50值之間存在顯著差異(P<0.05)，其水提物、醇提物的清除效果均弱于Vc，清除效果較好的5種香辛料為丁香、草果、桂皮、黑胡椒、豆蔻，其IC50值均低于3.6 mg/mL，具有一定的超氧陰離子自由基清除能力。清除效果最好的是丁香水提物，IC50值為(0.61±0.01) mg/mL。

2.4 相關(guān)性分析

表5 香辛料提取物多酚、黃酮含量與抗氧化能力之間的相關(guān)性Table 5 The coefficients among the content of polyphenols and flavonoids of spices' extracts and the antioxidant abilities

注：“*”表示在0.05水平上顯著相關(guān)；“**”表示在0.01水平上顯著相關(guān)。

由表5可知，香辛料水提物、醇提物的多酚含量與黃酮含量均與DPPH自由基清除能力顯著相關(guān)(P<0.01)，其中醇提物黃酮與DPPH自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)為0.855，高于水提物多酚含量與DPPH自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)，可知香辛料DPPH自由基清除能力與黃酮含量更為相關(guān)。香辛料水提物、醇提物的多酚含量與超氧陰離子自由基清除能力顯著相關(guān)(P<0.01)，水提物黃酮含量與其沒(méi)有顯著相關(guān)性，醇提物黃酮含量與其顯著相關(guān)(P<0.05)，可知香辛料超氧陰離子自由基清除能力與多酚含量更為相關(guān)。兩種不同的抗氧化模型更能體現(xiàn)香辛料的抗氧化活性。以上研究結(jié)果表明多酚與黃酮是香辛料提取物中抗氧化的主要成分。

3 討論

生物體內(nèi)自由基種類與反應(yīng)機(jī)制不盡相同[14,15]，本次實(shí)驗(yàn)建立兩種抗氧化模型以求更客觀地體現(xiàn)香辛料提取物抗氧化能力的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：香辛料水提物與醇提物均存在一定的抗氧化能力，其中大多數(shù)醇提物DPPH自由基清除效果好于水提物，大多數(shù)水提物超氧陰離子自由基的清除效果好于醇提物。根據(jù)相關(guān)性分析表明，香辛料提取物中黃酮化合物與DPPH自由基清除率更為相關(guān)，香辛料提取物中酚類化合物則與超氧陰離子自由基的清除率更為相關(guān)，因此香辛料抗氧化能力應(yīng)從兩種化合物含量方面綜合考量。

在14種香辛料中，丁香的抗氧化活性最好，DPPH自由基清除率IC50值為(0.01±0.03) mg/mL，超氧陰離子自由基清除率IC50值為(0.60±0.04) mg/mL，在低濃度時(shí)即擁有良好的清除率，同時(shí)多酚、黃酮含量較高，其中醇提物的黃酮含量為(97.65±1.91) mg/g，在同類香料中含量最高。除丁香外，桂皮、花椒也具有良好的抗氧化能力，醇提物的多酚含量大于50 mg/mL，醇提物的黃酮含量大于80 mg/mL，具有良好的開(kāi)發(fā)前景。本實(shí)驗(yàn)研究了香辛料的抗氧化性與黃酮、多酚含量的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究、篩選香辛料提取物的抗氧化成分提供了借鑒，為天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)提供了技術(shù)參考。