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        新疆釀酒葡萄表皮醋酸菌的分離鑒定及產(chǎn)酸條件優(yōu)化

        2019-04-11 08:20:42,,,,*
        中國(guó)調(diào)味品 2019年4期
        關(guān)鍵詞:產(chǎn)酸量產(chǎn)酸無水乙醇

        ,,,,*

        (1.石河子大學(xué) 食品學(xué)院,新疆 石河子 832000;2.石河子大學(xué)信息科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆 石河子 832000)

        新疆地大物博,氣候獨(dú)特,瓜果品種多、種植面積大、糖度極高、品質(zhì)優(yōu)良,但由于加工和銷路的問題,每年產(chǎn)生大量的廢渣和殘次果,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。果醋是一種以果蔬或其下腳料為主要原料,通過酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵而成的具有多種營(yíng)養(yǎng)成分和保健功能的液態(tài)食品[1,2]。因此,發(fā)展新疆特色果醋能夠快速、有效地解決新疆果品加工廢渣及殘次果經(jīng)濟(jì)損失的問題。

        醋酸菌種是決定果醋產(chǎn)量和質(zhì)量的主要因素之一。目前,果醋釀造的優(yōu)良菌株分為醋酸桿菌屬(Acetobacter)和葡糖桿菌屬(Gluconobacter)2個(gè)屬。常用的釀造用醋酸菌還有奧爾蘭醋桿菌(A.orleanense)、許氏醋桿菌(A.schuegenbachii)、產(chǎn)醋醋酸桿菌(A.acetigenum)、彎曲醋桿菌(A.curvum)、紋膜醋桿菌(A.aceti)、惡臭醋酸桿菌(A.rancens)、攀膜醋桿菌(A.ascendans)、膠膜醋桿菌(A.xylinum)等[3,4]。本文以新疆釀酒葡萄為原料,篩選高產(chǎn)酸醋酸菌,為新疆特色果醋業(yè)的發(fā)展以及果蔬加工產(chǎn)業(yè)鏈的延伸奠定了一定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 采樣

        從新疆石河子142團(tuán)采集10例赤霞珠釀酒葡萄。

        1.1.2 主要試劑與儀器

        葡萄糖、酵母浸粉、瓊脂粉、蛋白胨、氫氧化鈉、丙三醇、酵母膏、DNA Marker和ddH2O:購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;碳酸鈣、無水乙醇、Easy Taq Supermix:購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;Gold View、DNA Kit:購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司,以上試劑均為分析純。

        5810R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf儀器公司;TC-512PCR擴(kuò)增儀 英國(guó)Techne公司;Power Pac Universal電泳儀、Gel DOC XR凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)BioRad公司;CX21FS1光學(xué)顯微鏡 Olympus 公司;LAC-5040S全自動(dòng)高壓滅菌鍋 浙江新豐醫(yī)療器械有限公司;SW-CJ超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;GNP-9272智能生化培養(yǎng)箱 上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司。

        1.1.3 培養(yǎng)基

        篩選培養(yǎng)基:葡萄糖(1%)、酵母膏(1%)、碳酸鈣(2%)、無水乙醇(3%)、自然pH,121 ℃高壓滅菌20 min,冷卻至60 ℃以下再加入無水乙醇[5]。

        發(fā)酵培養(yǎng)基(GYPE):葡萄糖(0.1%)、蛋白胨(0.2%)、酵母膏(0.5%)、無水乙醇(6%)、121 ℃高壓滅菌20 min,冷卻至60 ℃以下再加入無水乙醇[6]。

        1.2 方法

        1.2.1 樣品處理

        稱取20 g葡萄樣品,在無菌條件下,將其加入到裝有50 mL無菌水的三角瓶中,并放置三角瓶于搖床中,在30 ℃、120 r/min條件下,培養(yǎng)12 h,得菌懸液。

        1.2.2 菌株的分離純化

        采用梯度稀釋平板涂布法對(duì)葡萄樣品進(jìn)行分離,在30 ℃恒溫條件下培養(yǎng)48 h。經(jīng)連續(xù)劃線培養(yǎng)2~3次后,參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[7],與張紀(jì)中的《微生物分類學(xué)》進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)菌落的形態(tài)、大小、顏色進(jìn)行初步分類鑒定,革蘭氏染色,將革蘭氏染色陰性菌(顯微鏡下為紅色)純培養(yǎng)物經(jīng)液體培養(yǎng)基富集之后按600 μL甘油和水混合液(1∶1),將400 μL液體培養(yǎng)物移入1.5 mL離心管中,保藏5份至-20 ℃冰箱中,并做好標(biāo)記。

        1.2.3 醋酸菌的16S rDNA分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

        菌體DNA的提?。涸囼?yàn)DNA的提取采用Easy Pure Bacteria Genomic DNA Kit試劑盒,根據(jù)試劑盒提供藥品和說明書步驟進(jìn)行DNA的提取。

        PCR擴(kuò)增[8]:

        上游引物:27F-5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′;

        下游引物:1492R-5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′。

        擴(kuò)增體系:總體積為50 μL,其中包括2 μL的模板DNA,2 μL的上游引物,2 μL的下游引物,25 μL的Easy Taq Supermix,19 μL的ddH2O,并做空白對(duì)照。

        擴(kuò)增程序[9]:94 ℃預(yù)變性5 min,進(jìn)行30個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)為94 ℃變性45 s,53 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,然后再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)[10],并置于-20 ℃保藏以備后續(xù)試驗(yàn)所用。

        將符合標(biāo)準(zhǔn)的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI(National Center for Biotechnology Information)BLAST中進(jìn)行同源序列比對(duì),根據(jù)比對(duì)的結(jié)果,下載相似性在99%以上菌種的16S rDNA序列,連同測(cè)序菌株的序列用Claustal X1.83軟件進(jìn)行多序列比對(duì),結(jié)果采用MEGA 6.0軟件中的鄰近法(Neighbor-Joining)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建,并用Bootstrap對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行1000次置信度分析[11]。

        1.2.4 總酸的測(cè)定

        取-20 ℃下保存的菌種在液體培養(yǎng)基中活化,加入5%的活化菌液于50 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,置于搖床于30 ℃,170 r/min進(jìn)行培養(yǎng),待測(cè)總酸。

        24 h測(cè)1次樣品相關(guān)的數(shù)據(jù),對(duì)樣品搖勻后在無菌操作臺(tái)中進(jìn)行,并且用空白培養(yǎng)基作為空白對(duì)照,用堿式滴定法測(cè)量菌種產(chǎn)酸量,用移液槍吸取2 mL至三角瓶中進(jìn)行滴定,然后用下式計(jì)算出總酸[12]:

        產(chǎn)酸量(g/L)=V/V0×CNaOH×60/L。

        式中:V為發(fā)酵液樣品滴定耗用的NaOH的體積數(shù),mL;V0為以空白培養(yǎng)基為對(duì)照滴定耗用的NaOH的體積數(shù),mL;CNaOH為NaOH溶液的濃度,mol/L;L為樣品的體積數(shù),mL;60為醋酸的分子量。

        1.2.5 高產(chǎn)酸菌株的篩選

        接種5%的液體培養(yǎng)物于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行7天發(fā)酵實(shí)驗(yàn),每天測(cè)其總酸,比較產(chǎn)酸量及產(chǎn)酸能力,篩選出產(chǎn)酸最高的菌株。

        1.2.6 培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)[13]

        1.2.6.1 不同濃度無水乙醇對(duì)高產(chǎn)菌株產(chǎn)酸能力的影響

        活化產(chǎn)酸最高的菌株,按照5%的接種量分別接種于2%,4%,6%,8%,10%乙醇的GYPE培養(yǎng)基中,將其置于30 ℃搖床中發(fā)酵24 h,每組3個(gè)平行,并做空白對(duì)照。

        1.2.6.2 不同濃度葡萄糖對(duì)高產(chǎn)菌株產(chǎn)酸能力的影響

        活化產(chǎn)酸最高的菌株,按照5%的接種量分別接種于0.5%,1%,1.5%,2%,2.5%葡萄糖的GYPE培養(yǎng)基中,將其置于30 ℃搖床中發(fā)酵24 h,每組3個(gè)平行,并做空白對(duì)照。

        1.2.6.3 不同濃度酵母膏對(duì)高產(chǎn)菌株產(chǎn)酸能力的影響

        活化產(chǎn)酸最高的菌株,按照5%的接種量分別接種于0.5%,1%,1.5%,2%,2.5%酵母膏的GYPE培養(yǎng)基中,將其置于30 ℃搖床中發(fā)酵24 h,每組3個(gè)平行,并做空白對(duì)照。

        1.2.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

        根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果,先對(duì)微生物生長(zhǎng)有重要影響的碳源和氮源,即葡萄糖、酵母膏、無水乙醇的用量,按照L9(33)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[14],各因素水平見表1。

        表1 產(chǎn)酸條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Optimization of orthogonal test factors and levels of acid-producing conditions %

        1.2.8 數(shù)據(jù)處理與分析

        采用Origin 8.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行單因素分析,用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行正交分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 醋酸菌的分離

        通過初步分離純化,共篩選得到15株醋酸菌,通過菌落形態(tài)和革蘭氏染色顯微形態(tài)比較,將篩選出的醋酸菌初步分為5類,菌落形態(tài)特征與顯微形態(tài)特征見表2和圖1。

        表2 培養(yǎng)基上醋酸菌的形態(tài)特征Table 2 Morphological characteristics of lactic acid bacteria on culture medium

        圖1 醋酸菌革蘭氏染色圖Fig.1 Gram staining of acetic acid bacteria

        2.2 16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果

        選取每種表型中生長(zhǎng)活性最好的菌株作為代表菌株,分別標(biāo)號(hào)為K-1、K-2、K-3、K-4、K-5并提取其DNA。將提取的5株醋酸菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),在1500 bp左右出現(xiàn)了特異性擴(kuò)增條帶,且條帶較為明亮,PCR擴(kuò)增結(jié)果符合測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)。電泳檢測(cè)結(jié)果見圖2。

        圖2 16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖Fig.2 The electrophoresis detection map of 16S rDNA amplification products

        2.3 醋酸菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

        圖3 醋酸菌16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 16S rDNA phylogenetic tree of lactic acid bacteria

        由圖3可知,K-1、K-2、K-3與AcetobacterperoxydansJMC 25077同源性強(qiáng),屬于Acetobacterperoxydans(過氧化醋桿菌),K-4與AcetobacteroeniLMG 21952同源性強(qiáng),屬于Acetobacteroeni(葡萄酒醋酸桿菌),K-5與GluconobacteralbidusNBRC 3250同源性強(qiáng),屬于Gluconobacteralbidus(白葡糖桿菌)。

        2.4 高產(chǎn)酸醋酸菌種的篩選

        圖4 不同菌株產(chǎn)酸量的比較Fig.4 Comparison of acid production of different strains

        由圖4可知,在發(fā)酵至第5天時(shí)不同菌株的產(chǎn)酸量都呈快速上升趨勢(shì);發(fā)酵5天之后,產(chǎn)酸量呈緩慢上升趨勢(shì);當(dāng)發(fā)酵至第7 天時(shí),K-4菌株的產(chǎn)酸量最高,達(dá)到了4.2 g/dL。因此,選取K-4菌株作為后期產(chǎn)酸條件優(yōu)化的供試菌株。

        2.5 產(chǎn)酸條件的優(yōu)化

        2.5.1 不同濃度無水乙醇對(duì)K-4菌株產(chǎn)酸能力的影響

        圖5 不同濃度無水乙醇對(duì)K-4菌株產(chǎn)酸能力的影響Fig.5 Effect of different concentration of absolute ethanol on acid-producing ability of K-4 strain

        由圖5可知,K-4菌株的乙醇濃度不同,產(chǎn)酸量變化明顯,隨著濃度的升高,產(chǎn)酸量升高,6%以后逐漸下降。可知6%時(shí)產(chǎn)酸量最高,酒精是醋酸菌生長(zhǎng)代謝能量的提供者,酒精濃度越高,對(duì)醋酸菌生長(zhǎng)有抑制作用,所以培養(yǎng)基配制時(shí)最佳乙醇濃度為6%。

        2.5.2 不同濃度葡萄糖對(duì)K-4菌株產(chǎn)酸能力的影響

        圖6 不同濃度葡萄糖對(duì)K-4菌株產(chǎn)酸能力的影響Fig.6 Effect of different concentration of glucose on acid-producing ability of K-4 strain

        由圖6可知,K-4菌株葡萄糖濃度在2%時(shí)產(chǎn)酸量最高,大于2%時(shí)產(chǎn)酸量逐漸降低。隨著葡萄糖濃度的升高,細(xì)菌繁殖能力增強(qiáng)。但是當(dāng)葡萄糖添加量增加到2.5%時(shí),細(xì)菌繁殖能力下降,菌液濃度下降,所以在培養(yǎng)基配制時(shí)葡萄糖最佳添加量為2%。

        2.5.3 不同濃度酵母膏對(duì)K-4菌株產(chǎn)酸能力的影響

        圖7 不同濃度酵母膏對(duì)K-4菌株產(chǎn)酸能力的影響Fig.7 Effect of different concentration of yeast extract on acid-producing ability of K-4 strain

        由圖7可知,K-4菌株酵母膏濃度在1.5%時(shí)最佳,在1.5%之前,隨著酵母膏濃度的升高,產(chǎn)酸量增大,但隨著酵母膏濃度的升高,細(xì)菌產(chǎn)酸能力下降。所以,醋酸菌產(chǎn)酸量在1.5%時(shí)高于其他濃度,為最佳濃度。

        2.6 K-4菌株產(chǎn)酸正交試驗(yàn)

        K-4菌株產(chǎn)酸正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表3。

        表3 產(chǎn)酸條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Optimization of orthogonal test results and analysis of acid-producing conditions

        由正交表極差分析可知,對(duì)K-4菌株產(chǎn)酸影響的重要性為B>C>A,即葡萄糖濃度>無水乙醇濃度>酵母膏濃度。由正交試驗(yàn)結(jié)果可知,K-4菌株最佳產(chǎn)酸條件為A2B1C2,即酵母膏1.5%,葡萄糖1.5%,無水乙醇6%。

        3 結(jié)論

        通過對(duì)新疆釀酒葡萄赤霞珠表皮的醋酸菌進(jìn)行不斷篩選和純化,最終初步得到了15株醋酸菌,經(jīng)過對(duì)其鏡檢以及形態(tài)特征的對(duì)比,初步將其分成了5種類型,挑取5株活性較好的代表菌株進(jìn)行DNA提取和16S rDNA序列擴(kuò)增測(cè)序,NCBI序列比對(duì)結(jié)果表明:K-1、K-2、K-3屬于Acetobacterperoxydans(過氧化醋桿菌),K-4屬于Acetobacteroeni(葡萄酒醋酸桿菌),K-5屬于Gluconobacteralbidus(白葡糖桿菌)。

        通過對(duì)K-1、K-2、K-3、K-4、K-5進(jìn)行7天發(fā)酵試驗(yàn),結(jié)果表明K-4產(chǎn)酸能力最高,由正交表極差分析得出,對(duì)K-4菌株產(chǎn)酸影響的重要性為:B>C>A,即葡萄糖濃度>無水乙醇濃度>酵母膏濃度。所以,由正交試驗(yàn)結(jié)果可知,K-4菌株最佳產(chǎn)酸條件為A2B1C2,即酵母膏1.5%,葡萄糖1.5%,無水乙醇6%。

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