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(陜西省催化重點實驗室 陜西理工大學 化學與環(huán)境科學學院，陜西 漢中 723000)

我國是傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國，農(nóng)業(yè)經(jīng)濟是我國國民經(jīng)濟的基礎，也是農(nóng)村居民的主要經(jīng)濟來源。為提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量，降低病蟲害對作物產(chǎn)量的影響，化學農(nóng)藥的使用一直較為普遍。但是，近年來發(fā)生的多起農(nóng)藥殘留超標的食品安全事件，使得食品農(nóng)藥殘留引起了全球的普遍關注[1]。目前，農(nóng)作物病害防治的重點正逐步由化學防治轉向生物防治，尋找開發(fā)廣譜、高效、安全、低廉且抑菌性能較好的天然抗菌劑具有極為重要的現(xiàn)實意義[2,3]。天然抑菌劑按其來源主要包括植物源抑菌劑、動物源抑菌劑及微生物源抑菌劑。其中，植物源抑菌劑因其來源廣泛、分布廣泛、種類眾多而備受青睞。香辛料是一類具有芳香、辛香典型風味的天然植物性原料，我國擁有豐富的天然香料資源，是全球香辛料的主要生產(chǎn)種植和出口國[4]。香辛料用于食品加工行業(yè)，不僅可以調(diào)味增香，還具有一定的抑菌防腐效果。Gill等的研究表明，芫荽葉精油對真空包裝火腿中6種李斯特菌均具有較好的抗菌效果[5]；Zhang等發(fā)現(xiàn)迷迭香和甘草提取物的混合物對4種肉類腐敗和致病菌的抗菌活性都具有很好的抑制作用[6]。代亨燕等研究的丁香、花椒、大蒜、生姜4種香辛料對黃瓜和菜豆中致腐菌的抑制效果，結果證實丁香精油對黃瓜和菜豆中致腐菌的抑制效果明顯大于其他3種香辛料精油[7]。目前文獻報道的香辛料的抑菌活性研究主要集中于食品、化妝品和醫(yī)學微生物等方面[8-11]，鮮有對植物病原菌的抑菌活性的系統(tǒng)比較。

本文通過研究花椒、辣椒、生姜和大蒜4種香辛料的乙醇提取物對馬鈴薯干腐病菌、番茄灰霉病菌、尖孢鐮刀病菌、蘋果炭疽病菌、水稻稻瘟病菌和蘋果腐爛病菌6種植物真菌的抑菌活性，探討香辛料對不同植物病原菌的抑制作用，為研究和開發(fā)新型高效植物源抑真菌劑提供了科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

馬鈴薯干腐病菌(Fusariumcoeruleum)、番茄灰霉病菌(Botrytiscintrea)、尖孢鐮刀病菌(Fusariumoxysporum)、蘋果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、水稻稻瘟病菌(Pyriculariagrisea)和蘋果腐爛病菌(Valsamali)，由陜西理工大學生物科學與工程學院微生物課題組保存。

1.1.2 材料與設備

市購花椒、辣椒、生姜、大蒜、馬鈴薯、葡萄糖：上海埃彼化學試劑有限公司；瓊脂：北京市奧星生物技術有限責任公司；無水乙醇(分析純)：天津市天利化學試劑有限公司。

SB3200DTDN超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；RE52-9型旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SW-CJ-IB型超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；SHP-80型生化培養(yǎng)箱 上海森德實驗儀器有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌箱 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 超聲波輔助浸提法制備香辛料提取原液

參照文獻[7]的方法，將干花椒、干辣椒用毛巾擦拭干凈后，置于真空干燥箱中，于60 ℃烘干24 h，粉碎過篩。準確稱取粉碎后的花椒粉末、辣椒粉末各20 g，分別置于500 mL圓底燒瓶內(nèi)按料液比1∶20加入無水乙醇，密封后放入超聲波清洗槽中，超聲30 min，靜置2天，過濾，濾渣用無水乙醇沖洗3次，將濾液收集，減壓蒸餾分別得到干花椒、干辣椒乙醇提取原液，并于冰箱中低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

參照文獻[12]的方法，將一定量的新鮮生姜、大蒜洗凈后晾干，切段，分別放入研缽中，加入石英砂充分粉碎，紗布過濾取濾液。濾渣轉入500 mL圓底燒瓶中，加入無水乙醇，密封后放入超聲波清洗槽中，超聲30 min，靜置2天，過濾。收集前后2次的濾液，得到生姜、大蒜乙醇提取原液，并于冰箱中低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 真菌固體培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)的制備

將200 g去皮的土豆切碎，加入1000 mL水，煮沸30 min后，用4層紗布過濾，除去馬鈴薯塊。濾液用自來水定容到1000 mL，再加入20 g瓊脂粉，加熱攪拌下使其溶解，最后加入20 g葡萄糖，pH自然，全部溶解后趁熱用4層紗布過濾，濾液用水定容至1000 mL，然后分裝在250 mL的三角瓶中并封口，用滅菌鍋(0.11 MPa、121 ℃)滅菌30 min，待用。

1.2.3 最小抑菌濃度測定結果

參照文獻[13]的測量方法，利用抑制菌絲生長速率法對合成的4種香辛料精油針對馬鈴薯干腐病菌(Fusariumcoeruleum)、番茄灰霉病菌(Botrytiscintrea)、尖孢鐮刀病菌(Fusariumoxysporum)、蘋果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、水稻稻瘟病菌(Pyriculariagrisea)和蘋果腐爛病菌(Valsamali)6種植物病原菌進行體外抗真菌活性的測試。在28 ℃下，所有菌種均在無菌PDA培養(yǎng)基上活化1周。花椒、辣椒、生姜和大蒜提取原液用丙酮按倍稀釋后，倒入無菌熔融的PDA培養(yǎng)基中，混合均勻后倒入無菌的培養(yǎng)皿中，待其冷卻凝固后，用7 mm的打孔器將活化好的測試菌種打成直徑為7 mm的菌餅，并將病原真菌菌餅接種在相應的培養(yǎng)基上，在28 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)72 h，然后結合細菌生長的痕跡判斷植物提取液的MIC。如果最低濃度的香辛料提取液處沒有菌種生長的跡象，則表明為該種香辛料對于參試菌種的MIC。

1.2.4 抑菌率的測定

在1.2.3 最小抑菌濃度測定試驗基礎上，按照MIC測定方法稀釋藥液，制備藥液平板。分別吸取適量體積的花椒、辣椒、生姜和大蒜提取原液加入一定體積PDA培養(yǎng)基，攪拌均勻得到濃度分別為3.75，7.50，15.00，30.00，60.00 mg/mL的香辛料的帶藥培養(yǎng)基，將其倒板、凝固。在每個無藥培養(yǎng)基平板上采用劃線法均勻的分別接種參加試驗的菌種馬鈴薯干腐病菌(Fusariumcoeruleum)、番茄灰霉病菌(Botrytiscintrea)、尖孢鐮刀病菌(Fusariumoxysporum)、蘋果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、水稻稻瘟病菌(Pyriculariagrisea)和蘋果腐爛病菌(Valsamali)。用無菌打孔器在菌落邊緣生長旺盛的瓊脂上打孔(d=7 mm)，放在加藥液的PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng),以無藥培養(yǎng)基內(nèi)加入同種菌種作為對照，平板密封，置于28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)4天，觀察并記錄菌圈直徑。每組6個平板，每個平板均勻放置3個菌餅，重復6次，十字交叉法測菌圈直徑，取平均值。

以相同操作，制備陰性對照丙酮的平板，并測試各菌種菌餅接種在無藥培養(yǎng)基上，做標記。于28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，統(tǒng)計菌落數(shù)，根據(jù)下式計算抑菌率：

2 結果與分析

2.1 4種食用香辛料的最小抑菌濃度測定結果

圖1 4種香辛料對馬鈴薯干腐病菌的最小抑菌濃度

由圖1可知4種食用香辛料對馬鈴薯干腐病菌的抑菌試驗結果，花椒提取物對馬鈴薯干腐菌的抑菌效果優(yōu)于辣椒提取液。相同稀釋倍數(shù)時，抑菌效果由高到低依次為：花椒>辣椒>生姜，抑菌效果隨稀釋倍數(shù)增大而緩慢降低。而大蒜提取液的抑菌活性與提取液濃度關系極大，抑菌圈直徑伴隨稀釋倍數(shù)增大而急劇增大，量效關系顯著。

圖2 4種香辛料對番茄灰霉病菌的最小抑菌濃度

由圖2可知，隨著稀釋倍數(shù)的增大，在分別含4種食用香辛料的培養(yǎng)基中，番茄灰霉病菌的抑菌圈直徑依次增大，且呈一定的線性關系。其中，含辣椒、大蒜和生姜提取液的培養(yǎng)基中，抑菌圈直徑變化較為相似；相同的稀釋倍數(shù)下，花椒提取液培養(yǎng)基抑菌試驗的抑菌圈直徑均小于其余3種食用香辛料，說明花椒提取物對番茄灰霉病菌的抑菌效果最好。

圖3 4種香辛料對尖孢鐮刀病菌的最小抑菌濃度

由圖3可知，對尖孢鐮刀病菌的抑制效果強弱次序為：花椒提取液>辣椒提取液>大蒜提取液>生姜提取液，提取稀釋倍數(shù)越大，菌圈直徑越大，抑菌效果越差。

圖4 4種香辛料對蘋果炭疽病菌的最小抑菌濃度

由圖4可知，含花椒提取液的抑菌圈直徑在稀釋倍數(shù)為2之前，小于其余3種食用香辛料，且抑菌圈直徑隨稀釋倍數(shù)的增大變化較大，即在稀釋倍數(shù)為2之前，花椒抑菌效果優(yōu)于其余3種香辛料。辣椒、大蒜和生姜提取液隨稀釋倍數(shù)的變化而發(fā)生相似變化，且變化程度相對花椒提取液較小。

圖5 4種香辛料對水稻稻瘟病菌的最小抑菌濃度

由圖5可知，大蒜提取液對水稻稻瘟病菌的抑制效果與其對馬鈴薯干腐病菌的抑制效果具有相似的規(guī)律，即量效關系顯著。

圖6 4種香辛料對蘋果腐爛病菌的最小抑菌濃度

由圖6可知，含花椒和大蒜提取液對蘋果腐爛病菌的抑菌效果同于兩者在圖5中的表現(xiàn)。稀釋倍數(shù)小于4.5時，含辣椒提取液的抑菌圈直徑大于大蒜提取液的抑菌圈直徑；在稀釋倍數(shù)大于4.5后，則相反。相同稀釋倍數(shù)下，含花椒提取液的抑菌效果優(yōu)于辣椒提取液，含辣椒提取液的抑菌效果優(yōu)于生姜提取液。

2.2 4種食用香辛料的抑菌率測定結果

表1 4種食用香辛料的抑菌率測定

由表1可知：(1)花椒提取液對6種真菌的抑制作用最強；其中，濃度為60 mg/mL時，對馬鈴薯干腐病菌、番茄灰霉病菌、蘋果炭疽病菌、水稻稻瘟病菌和蘋果腐爛病菌的抑制作用可達100%，且對5種真菌的MIC均為60 mg/mL；對馬鈴薯干腐病菌、番茄灰霉病菌和蘋果腐爛病菌的抑制作用在低濃度時相對較大；對蘋果炭疽病菌在低濃度時的抑制作用最??；(2)辣椒提取液在低濃度時對尖孢鐮刀病菌的抑制作用最??；相對于花椒提取液的抑菌效果而言，辣椒提取液的抑菌作用稍低；(3)大蒜提取液對馬鈴薯干腐病菌，水稻稻瘟病菌和蘋果腐爛病菌的抑制作用在濃度為60 mg/mL時，抑菌率達到100%；(4)生姜提取液對尖孢鐮刀病菌的抑制作用最弱；在3.75 mg/mL時，抑菌效果極低；對其他5種真菌的抑制效果較為相似；(5)4種天然香料的乙醇提取液對供試菌種均表現(xiàn)出一定的抑菌作用，花椒提取液表現(xiàn)出的抑菌效果最強。

花椒對6種植物源真菌的抑制作用見圖7，而6種植物源真菌的空白實驗見圖8。

圖7 花椒對6種植物源真菌的抑制作用

注：A為馬鈴薯干腐病菌；B為番茄灰霉病菌；C為尖孢鐮刀病菌；D為蘋果炭疽病菌；E為水稻稻瘟病菌；F為蘋果腐爛病菌。

圖8 6種植物源真菌的空白實驗

注：a為馬鈴薯干腐病菌；b為番茄灰霉病菌；c為尖孢鐮刀病菌；d為蘋果炭疽病菌；e為水稻稻瘟病菌；f為蘋果腐爛病菌。

3 結論與討論

4種香辛料對6種測試植物真菌菌種均具有一定的抑菌活性，同時抑菌濃度與抑菌效果之間基本表現(xiàn)出了正量效關系?；ń?、辣椒、生姜和大蒜對番茄灰霉病菌、馬鈴薯干腐病菌、水稻稻瘟病菌、蘋果腐爛病菌和蘋果炭疽病菌的抑制效果較為明顯；但對尖孢鐮刀病菌表現(xiàn)出的抑菌效果相較而言較弱。4種天然香料中，花椒提取液的抑菌效果最強。本研究中的4種材料對植物病原真菌具有廣譜的抑菌活性，除可作為抗菌食品和天然防腐劑外，4種天然的植物香辛料還可有效抑制真菌生長，而且對環(huán)境友好，在未來植物精油及其活性成分方面有望代替化學合成藥劑進行抑菌防霉，成為新型綠色防霉抑菌劑之一，具有巨大的開發(fā)潛力和廣闊的應用前景。