付亞娟，張 劍，付琦媛，侯曉強*

(1.廊坊師范學院 生命科學學院，河北 廊坊 065000；2.河北省高校食藥用菌應用技術研發(fā)中心，河北 廊坊 065000；3.廊坊職業(yè)技術學院，河北 廊坊 065000)

【研究意義】大花杓蘭(CypripediummacranthumSw.)，隸屬蘭科杓蘭屬，是集觀賞價值和藥用價值于一體的地生蘭植物。近些年，由于過度采挖及棲息地的破壞，我國野生大花杓蘭種群數(shù)量急劇下降[1]。大花杓蘭與絕大多數(shù)蘭科植物一樣，也是典型菌根植物，其成熟種子萌發(fā)、幼苗生長均與菌根真菌密切相關，但有關大花杓蘭菌根真菌的研究報道較少。研究大花杓蘭根際土壤真菌及潛在蘭科菌根真菌群落的組成對于大花杓蘭的保育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】侯曉強等[2]采用組織分離方法對北京和吉林大花杓蘭內生真菌進行研究，發(fā)現(xiàn)北京大花杓蘭優(yōu)勢菌群為毛殼菌屬(Chaetomium)和莖點霉屬(Phorna)，而吉林大花杓蘭內生真菌優(yōu)勢菌群為毛殼菌屬(Chaetomium)真菌。張毓等[3]從大花杓蘭根系中分離到一株瘤菌根菌屬(Epulorhiza)真菌，并證實該真菌能有效促進大花杓蘭種子萌發(fā)。Shimura等[4]研究也證實瘤菌根菌屬真菌能促進大花杓蘭(Cypripediummacranthosvar.rebunense)種子萌發(fā)，但相對于幼苗及原球莖，來自成株的瘤菌根菌屬真菌具有更高的促萌發(fā)率。張亞平[5]研究發(fā)現(xiàn)，雞油菌目(Cantharellales)內生真菌對大花杓蘭原球莖的生長發(fā)育有促進作用?！颈狙芯壳腥朦c】最新研究發(fā)現(xiàn)，蘭科植物特異的菌根真菌主要分布在其成株周圍土壤，其菌根真菌的豐度隨距蘭科植物地理距離增加而下降[6-7]。大花杓蘭作為蘭科植物保護中的“旗艦類群”，其根際土壤真菌及潛在蘭科菌根真菌的相關研究目前尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究采用克隆文庫技術對北京百花山野生大花杓蘭根際土壤真菌及潛在蘭科菌根真菌的群落組成進行初步分析，旨在為將來分離篩選大花杓蘭種子共生萌發(fā)菌及野生種群遷地保育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

2017年6月份，對北京百花山國家級自然保護區(qū)(東經(jīng)115°25′～115°42′，北緯39°48′～ 40°05′)的大花杓蘭根際土壤進行采樣。大花杓蘭是瀕危蘭科植物，所以本研究將大花杓蘭須根系表面0～3 cm范圍內5～15 cm土層的土壤視為其根際土壤。采樣方法采取五點混合采樣法。將五點采集的根際土樣分別裝在無菌自封袋中，當天帶回實驗室。所有土壤樣本過2 mm篩后，等量充分混勻，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤宏基因組DNA的提取 采用土壤DNA提取試劑盒(FastDNA SPIN Kit for Soil，USA)對土壤宏基因組DNA進行分離，其操作按照試劑盒說明書進行。所提取DNA的完整性采用0.7 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.2 土壤真菌ITS序列的PCR擴增 以提取的土壤DNA為模板，采用特異引物ITS1-OF和ITS4-OF[8]對大花杓蘭根際土壤真菌ITS序列進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μl：2×PCR Master 12.5 μl，DNA模板2 μl，引物ITS1-OF和ITS4-OF(10 μmol/L)各1 μl，BSA(25 mg/mL)2 μl，最后加ddH2O至25 μl。PCR程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，60 ℃復性30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min。1.0 %瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測。

1.2.3 土壤真菌ITS序列的克隆及測序 將3次擴增的PCR產(chǎn)物混合后，采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(生工，上海)進行純化回收，其操作按照試劑盒說明書進行。將上述純化的PCR產(chǎn)物與克隆載體pGM-T(天根，北京)進行連接，連接產(chǎn)物轉化EscherichiacoliTOP10感受態(tài)細胞(天根，北京)。經(jīng)藍白斑篩選及菌落PCR驗證后，隨機挑選100個陽性克隆送上海生工測序，測序引物為載體pGM-T上通用引物T7。

1.2.4 序列分析、OUT分類及系統(tǒng)發(fā)育分析 將測序得到的所有ITS序列首先采用Chromas軟件打開，觀察峰圖，排除雙峰序列，獲得良好DNA序列；而后通過Dnastar7.1去除載體冗余序列；基于97 %序列相似水平劃分可操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)[9]。對于每個OUT，隨機選取一條代表性序列，該序列通過與GenBank中已有序列進行Blastn比對，以確定ITS序列所對應的物種分類地位。綜合蘭科植物菌根真菌多年的研究報道，確定潛在的蘭科菌根真菌OUT及代表的ITS序列。參照蓋雪鴿等[10]的方法，構建蘭科菌根真菌OUT的分子系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其親緣關系及分類地位。

2 結果與分析

2.1 大花杓蘭根際土壤真菌類群分析

從大花杓蘭根際土壤真菌ITS克隆文庫中隨機選取100個陽性克隆，經(jīng)測序、去除載體冗余序列及校對后，獲得96個有效的真菌克隆。其中44個克隆為未知真菌(45.83 %)，接合菌門真菌14個克隆(14.58 %)，子囊菌門真菌7個克隆(7.29 %)，球囊菌門和壺菌門真菌各1個克隆(1.04 %)，其余均為擔子菌門真菌，占克隆總數(shù)的30.22 %(圖1)。

圖1 大花杓蘭根際土壤真菌群落相對豐度Fig.1 Relative abundance of C. macranthum rhizosphric fungi at phylum level

除了未知真菌，其他52個真菌克隆基于97 %的同源相似性水平，將其劃分為24個操作分類單元(表1)。它們可以歸納為3類，第1類是序列同源相似性>=98 %，可以鑒定到具體的屬或種，共10個OTUs，占克隆總數(shù)的51.93 %，分別為OTU2、OTU5、OTU10、OTU13、OTU14、OTU15、OTU17、OTU18、OTU20、OTU23。第2類是可以鑒定到具體的屬或種，但序列比對相似性<98 %，推測其可能為已知序列的近緣類群，涉及OTU1、OTU6、OTU7、OTU8、OTU9、OUT16、OTU21、OTU22，占克隆總數(shù)的32.69 %。第3類是不能確定其具體分類地位，只鑒定到細菌門、綱、目和科，共6個OTUs，包括OTU3、OTU4、OTU11、OTU12、OTU19、OTU24，占克隆總數(shù)的15.38 %。

由表1顯示，所獲得的24個真菌操作分類單元(OTUs)中，14個擔子菌，5個子囊菌，3個結合菌，1個壺菌和1個球囊菌。擔子菌分屬于5目9科9屬，其中4個OTUs(OTU1-4)屬于雞油菌目Cantharellales，其最匹配的序列分別為絲核菌屬Rhizoctonia、角擔菌屬Ceratobasidium和膠膜菌科Tulasnellaceae；與OTU9最匹配序列為糙孢孔目Trechisporales的粗糙孔菌屬Trechispora；OTU13最匹配序列是線黑粉菌目Filobasidiales的Solicoccozyma屬；OTU14最匹配序列是伏革菌目Corticiales的擬射脈菌屬Phlebiella；除了2個OTUs(OTU11和OTU12)只鑒定到傘菌綱和傘菌目，其余5個OTUs最匹配的序列依次屬于傘菌目Agaricale的小菇屬Mycena(OTU7)、濕傘屬Hygrocybe(OTU5和OTU6)、粉褶蕈屬Entoloma(OTU8)和小脆柄菇屬Psathyrella(OTU10)。已鑒定的子囊菌中，除了OTU19鑒定到子囊菌門，其余4個OTUs分屬于3目4屬，2個OTUs(OTU15和OTU16)屬于格孢腔菌目Pleosporales的殼二孢屬Ascomycota和Chaetosphaeronema屬；另2個OTUs(OTU17和OTU18)分別屬于煤炱目Capnodiales的亞球殼屬Sphaerulina和縱裂菌目Hysteriales的Psiloglonium屬。接合菌的3個OTUs(OTU20-22)均屬于被孢霉目Mortierellales的被孢霉屬Mortierella。與OTU23最匹配的序列是壺菌門Chytridiomycota的根生壺菌屬Rhizophydium；與OTU24最匹配的序列為球囊菌門Glomeromycota的多孢囊霉科Diversisporaceae。

表1 大花杓蘭根際土壤菌根真菌OTUs列表

注：A代表子囊菌門；B代表擔子菌門；C代表壺菌門；G代表球囊菌門；Z代表接合菌門。

Note: A represents Ascomycota; B represents Basidiomycota; C represents Chytridiomycota; G represents Glomeromycota; Z represents Zygomycota.

圖2 大花杓蘭根際土壤真菌群落相對豐度Fig.2 Relative abundance of rhizosphric fungi on C. macranthum

2.2 根際土壤真菌類群相對豐度分析

本研究共獲得96個真菌克隆，分屬于5門6綱11目16科15屬。從“目”這一分類層次來看，優(yōu)勢真菌類群主要分布在被孢霉目Mortierellales、傘菌目Agaricales和雞油菌目Cantharellales，其所占比例總和達到39.58 %；其次是格孢腔菌目Pleosporales(3.12 %)、糙孢孔目Trechisporales(2.08 %)和煤炱目Capnodiales(2.08 %)(圖2A)。從“科”分類水平來看，被孢霉科Mortierellaceae(14.58 %)最為豐富，其次是角單菌科Ceratobasidiaceae(8.33 %)和蠟傘科Hygrophoraceae(6.25 %)，再次是膠膜菌科Tulasnellaceae(3.12 %)和粉褶菌科Entolomataceae(3.12 %)(圖2B)。在“屬”水平上，相對豐度(>2 %)的8個屬所占比例總和達到38.52 %，相對豐度最大的5個屬依次為被孢霉屬Mortierella(14.58 %)、濕傘屬Hygrocybe(6.25 %)、角擔菌屬Ceratobasidium(5.21 %)、絲核菌屬Rhizoctonia(3.12 %)和粉褶蕈屬Entoloma(3.12 %) (圖2C)。

2.3 大花杓蘭根際土壤蘭科菌根真菌分析

由表1顯示，對24個大花杓蘭根際土壤真菌OTUs進行分析，發(fā)現(xiàn)4個OTUs(OTU1-4)可能為潛在的蘭科菌根真菌。從GenBank中下載與每個OTU(OTU1-4)最相似的序列，用Mega5.1構建菌根真菌系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。大花杓蘭根際土壤真菌分為3枝，其中一進化枝為角擔菌科Ceratobasidiaceae，包括2個OTUs(OTU1和OTU2)，另2個進化枝為膠膜菌科(Tulasnellaceae Ⅰ 和Tulasnellaceae Ⅱ)各包含1個OUT，分別為OTU3和OTU4。根據(jù)真菌群落相對豐度(圖2B和2C)，發(fā)現(xiàn)大花杓蘭根際土壤中蘭科菌根真菌在科水平上主要為Ceratobasidiaceae真菌；在屬水平上，優(yōu)勢菌群為角擔菌屬Ceratobasidium真菌。

3 討 論

根際微生物是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，微生物群落的組成及豐度與植物生長發(fā)育、土傳病害的發(fā)生發(fā)展密切相關。研究瀕危蘭科植物大花杓蘭根際微生物的群落組成對于大花杓蘭的保育具有重要意義。本研究采用克隆文庫技術對大花杓蘭根際土壤真菌群落多樣性進行初步分析，結果發(fā)現(xiàn)大花杓蘭根際土壤中擔子菌為優(yōu)勢類群，所獲得的24個OUTs中，擔子菌14個OUTs，占OUT總數(shù)的58.33 %；子囊菌5個OUTs，接合菌3個OUTs，壺菌門和球囊霉門真菌各1個OUT。從“目”層次來看，優(yōu)勢真菌類群為被孢霉目、傘菌目和雞油菌目；從“科”分類水平來看，被孢霉科最為豐富，其次是角單菌科和蠟傘科，再次是膠膜菌科和粉褶菌科。在“屬”水平上，相對豐度(>3 %)的4個屬依次為被孢霉屬、濕傘屬、角擔菌屬和絲核菌屬。從生態(tài)功能上講，24個OUTs中有6個OTUs為植物菌根真菌，其中蘭科菌根真菌4個(OTU1-4)，外生菌根真菌2個(OTU7-8)。

圖3 基于ITS序列的角單菌科和膠膜菌科真菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree for the Ceratobasidiaceae and Tulasnellaceae (OTU1-4) based on rDNA-ITS sequences

蘭科植物為典型的菌根植物，通常認為生活在蘭科植物內的菌根真菌與宿主協(xié)同演化，形成了互惠共生關系。也有觀點認為，蘭科菌根真菌的生長可以不依賴宿主，但蘭科植物從種子萌發(fā)到幼苗生長都高度依賴菌根真菌，甚至有些蘭科植物在整個生命周期都依賴菌根真菌[11-12]。盡管蘭科菌根共生機制仍存在爭議，但都體現(xiàn)了菌根真菌對蘭科植物生長發(fā)育的重要性。本研究發(fā)現(xiàn)大花杓蘭根際土壤潛在的蘭科菌根真菌是擔子菌的膠膜菌科Tulasnellaceae和角單菌科Ceratobasidiaceae真菌，它們均已被證實為大多數(shù)熱帶、溫帶蘭科植物菌根真菌的優(yōu)勢類群[11]。Shefferson等[13]研究發(fā)現(xiàn)，膠膜菌科Tulasnellaceae真菌是來自歐洲和北美7種杓蘭屬植物(Cypripediumcalceolus,Cypripediumcalifornicum,Cypripediumcandidum,Cypripediumfasciculatum,Cypripediumguttatum,Cypripediummontanum,Cypripediumparviflorum)的主要菌根真菌，偶見角擔菌科Ceratobasidiaceae和蠟殼耳科Sebacinaceae真菌。繆?？〉萚14]研究結果表明，膠膜菌屬真菌對滇西北4個不同居群的黃花杓蘭(Cypripediumflavum)具有一定的寄主專一性。角擔菌科也在很多蘭科植物的菌根真菌中占主導地位[15-16]。Oja等[17]研究發(fā)現(xiàn)，二葉舌唇蘭(Platantherachlorantha)和四裂紅門蘭(Orchismilitaris)周圍土壤中潛在的蘭科菌根真菌(蠟殼耳目Sebacinales、膠膜菌科Tulasnellaceae和角單菌科Ceratobasidiaceae)，也同樣存在于它們的根中，只是相對豐度不同。土壤中蠟殼耳目真菌占優(yōu)勢，而角單菌科和膠膜菌科分別為P.chlorantha和O.militaris的優(yōu)勢類群。對比Oja等[17]的研究結果，發(fā)現(xiàn)大花杓蘭根際土壤未檢測到蠟殼耳目Sebacinales菌根真菌，可能由于不同種蘭科植物及土壤環(huán)境影響菌根真菌組成。

除了占主導地位的膠膜菌科和角擔菌科外，本研究還檢測到了粗糙孔菌屬Trechispora、小脆柄菇屬Psathyrella、被孢霉屬Mortierella、濕傘屬Hygrocybe等潛在菌根真菌類群的存在。粗糙孔菌屬真菌作為蘭科植物菌根真菌的研究報道較少，Huang等[18]報道該屬真菌可能為蝶蘭Phalaenopsis的菌根真菌。小脆柄菇屬Psathyrella也被認為與蘭科植物相關，但在蘭科菌根研究中作為偶見種類[19]。據(jù)零星報道，大花杓蘭根際土壤中占絕對優(yōu)勢的被孢霉屬Mortierella也被認為是潛在蘭科菌根真菌，它可能通過促進植物根系吸收礦質元素或抑制病原菌，進而促進蘭科植物生長發(fā)育[20]。濕傘屬Hygrocybe曾在外生菌根真菌研究中有發(fā)現(xiàn)[21]。小菇屬Mycena和粉褶菌屬Entoloma分別作為蘭科菌根真菌和外生菌根真菌已有報道[22]，但本研究發(fā)現(xiàn)OUT7和OUT8分別與GenBank中Mycenaacicula(JF908384)和Entolomasubserrulatum(KY706168)的序列相似性僅為85 %和87 %，推測它們可能為小菇屬和粉褶菌屬的近緣物種。因此在這里沒有將小菇屬和然粉褶菌屬劃分到菌根真菌進行討論。

近年來，蘭科植物周圍土壤中蘭科菌根真菌的研究備受關注。Waud等[6]研究發(fā)現(xiàn)，與蘭科植物共生的菌根真菌廣泛分布于土壤中，但菌根真菌群落組成的變化與近端宿主植物密切相關。Oja等[17]也取得與Waud相似的研究結果，發(fā)現(xiàn)土壤中潛在的蘭科菌根真菌也存在蘭科植物的根中，但菌根真菌相對豐度不同。Voyron等[23]的研究結果表明，與蘭科植物相關的某些菌根真菌類群在土壤中未被發(fā)現(xiàn)。鑒于大花杓蘭根際土壤潛在蘭科菌根真菌的相關研究目前尚未見報道，因此本研究通過分子手段，對其根周圍土壤真菌類群及潛在蘭科菌根真菌進行初步分析，發(fā)現(xiàn)土壤中潛在的蘭科菌根真菌為雞油菌目的角單菌科和膠膜菌科真菌。綜合上述研究報道，認為大花杓蘭根周圍土壤中菌根真菌，在一定程度上能反映其根內的菌根真菌類群。另外，已有研究表明，雞油菌目真菌能促進大花杓蘭原球莖的生長和發(fā)育[5]，而膠膜菌科的瘤菌根菌屬真菌對大花杓蘭種子有促萌發(fā)作用[3-4]。因此，推測角單菌科和膠膜菌科真菌可能為大花杓蘭重要的菌根真菌，其研究結果將為大花杓蘭的保育和人工繁殖提供理論依據(jù)。

4 結 論

本研究采用克隆文庫技術對瀕危蘭科植物大花杓蘭根際土壤真菌及蘭科菌根真菌群落組成進行初步分析，發(fā)現(xiàn)被孢霉屬Mortierella為大花杓蘭根際土壤真菌的優(yōu)勢類群；根際土壤中所檢測到的潛在蘭科菌根真菌為膠膜菌科Tulasnellaceae、角擔菌科Ceratobasidiaceae的絲核菌屬Rhizoctonia和角擔菌屬Ceratobasidium真菌。