張 慶，白亭亭，李銘剛，何 翔，徐勝濤，倪 明 ，番華彩，曾 莉，楊佩文*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，云南 昆明 650205；2.云南大學(xué)，云南 昆明 650091；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，云南 昆明 650201)

【研究意義】 楊佩文等針對馬來西亞鏈霉菌S.malaysiensisECO 00002活性化合物分離及結(jié)構(gòu)分析顯示，該菌株活性部位主要含兩種結(jié)構(gòu)類似的同系化合物，經(jīng)HPLC制備純化，并通過詳細的1H和13C NMR數(shù)據(jù)測定及文獻對比分析，確定活性化合物為阿扎霉素F3和F4[1]。前期生物活性測定結(jié)果表明，其對多種植物病原真菌有較強的抑菌活性[2]。然而前期研究表明，該活性化合物產(chǎn)量較低，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要，限制了對它的進一步研究和開發(fā)利用?！厩叭搜芯窟M展】阿扎霉素 F類化合物最早于1959年由Arai從吸水鏈霉菌阿扎霉素變種(S.hygroscopicusvar.azalomyceticus) 中分離得到，主要成分為3 個36 元多羥基大環(huán)內(nèi)酯化合物阿扎霉素 F5a、F4a和 F3a[3-5]，目前報道的該類化合物約30個[6-7]。阿扎霉素 F類化合物具有高效廣譜抗植物病原真菌活性，小鼠(mouse)口服LD50為300～580 mg/kg，大鼠(rat)口服LD50為980 mg/kg，其毒性分級為低毒III級，具備開發(fā)為防治作物真菌病害的低毒高效農(nóng)用抗生素的潛力[8]?！颈狙芯康那腥朦c】根據(jù)該菌株生長特性和活性化合物阿扎霉素F合成的條件需求，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，創(chuàng)造適合菌株生長和目標活性化合物合成的最佳條件，充分發(fā)揮菌種的生產(chǎn)潛力，是提高菌株發(fā)酵水平和降低生產(chǎn)成本的有效途徑[9-10]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以提高馬來西亞鏈霉菌ECO 00002的阿扎霉素F產(chǎn)量為目標，在對菌株種子培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，重點考察碳氮源對目標活性化合物生物合成的影響，篩選適宜的碳氮源，優(yōu)化其配比，并進一步優(yōu)化菌株發(fā)酵條件，為菌株發(fā)酵工藝產(chǎn)業(yè)化提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株

云南大學(xué)微生物研究所保藏菌種馬來西亞鏈霉菌S.malaysiensisECO-00002。

1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酵母膏4 g，葡萄糖4 g，麥芽膏5 g，復(fù)合維生素(維生素B11 mg，維生素B61 mg，核黃素1 mg，煙酸1 mg，苯丙氨酸1 mg，生物素1 mg，丙氨酸0.3 mg)，微量鹽(FeSO4·7H2O20 mg，MnCl2·2H2O 10 mg，ZnSO4·7H2O10 mg)，瓊脂20 g，水1000 mL，pH 7.5，制作平板和試管斜面。液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖14.5 g，酵母膏15 g，麥芽膏20 g，CaCO33 g，MgSO4·7H2O 1 g，MnSO4·4H2O 0.1 g，KH2PO40.2 g，水1000 mL，pH 7.5。PB試驗和RSM試驗培養(yǎng)基：采用STATISTICA 6.0進行試驗設(shè)計，并配制相應(yīng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基于1×105Pa下滅菌20 min。

1.3 PB和RSA試驗方法

采用PB設(shè)計考察主要的碳氮源成分對阿扎霉素F產(chǎn)量的影響，篩選適宜的碳氮源；在此基礎(chǔ)上，采用RSA法優(yōu)化適宜碳氮源的比例。具體方法：將供試菌株接種于斜面試管培養(yǎng)基上，然后置于28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)120 h。再用滅菌蒸餾水洗下菌體，并按照10 % 的接種量接入裝有100 mL 種子培養(yǎng)基的500 mL 三角瓶中，28 ℃下200 r/min 振蕩培養(yǎng)至48 h。再取種子液10 mL接種于裝有100 mL發(fā)酵液(PB培養(yǎng)基和RSA培養(yǎng)基)的500 mL三角瓶中，于28 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，測定阿扎霉素F的含量。

1.4 發(fā)酵條件優(yōu)化試驗方法

在培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)上，采用單因素試驗進行溫度、起始pH、發(fā)酵瓶裝液量、接種量、發(fā)酵時間等發(fā)酵條件對阿扎霉素F產(chǎn)量的影響試驗。溫度設(shè)置24 ℃，28 ℃，32 ℃，36 ℃等4個梯度；pH值設(shè)置6.0，6.5，7.0，7.5，8.0等5梯度；裝液量設(shè)置50 mL/500 mL，75 mL/500 mL，100 mL/500 mL，125 mL/500 mL等4梯度；接種量設(shè)置2 %，4 %，6 %，8 %，10 %等5個梯度；發(fā)酵時間設(shè)置8，16，32，40，48，64，72，80，88，96，104 h等11個梯度。測定各試驗阿扎霉素F的含量。

1.5 發(fā)酵罐放大發(fā)酵試驗方法

利用50 L自動生物發(fā)酵罐驗證菌株擴大培養(yǎng)的發(fā)酵條件。將發(fā)酵罐內(nèi)外全面清洗干凈，檢查發(fā)酵罐的密閉性。用標準pH緩沖液對罐體上的pH監(jiān)測探頭進行校準。裝入配制好的優(yōu)化培養(yǎng)基25 L，關(guān)閉發(fā)酵罐頂蓋。通過發(fā)酵罐控制面板設(shè)定滅菌程序滅菌30 min。待溫度冷卻后，通過火焰圈接種法按10 %接種量接種。設(shè)定發(fā)酵參數(shù)：攪拌轉(zhuǎn)速150 r/min，溫度28 ℃，通氣量60 L/min，進氣壓力1.0 bar、罐內(nèi)壓0.3 bar。從24 h后開始定時取樣，取樣量為50 mL，測定菌體體積和阿扎霉素F的含量。

1.6 分析方法

菌體體積測定：將所取發(fā)酵液10 mL裝到帶刻度的試管中，靜置12 h后測量菌絲沉降體積。阿扎霉素F含量測定：取發(fā)酵液50 mL，進樣于經(jīng)過預(yù)處理的大孔樹脂層析柱，然后分別用甲醇∶水體積比為6∶4、7∶3、10∶0的洗脫液梯度洗脫，HPLC測定10∶0洗脫部分阿扎霉素F含量。HPLC系統(tǒng)采用Waters 515二元高壓泵，2966PDA檢測器，Hanban C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，柱溫30 ℃，流動相為甲醇∶水(8∶2)，檢測波長241.0 nm，進樣量20 μl，流速1.0 mL/min，分析時間20 min。含量根據(jù)色譜峰面積與標準品的峰面積對比進行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 PB試驗結(jié)果與分析

采用STATISTICA 6.0軟件進行PB試驗設(shè)計，對發(fā)酵培養(yǎng)組成中的葡萄糖、淀粉、酵母膏、大豆粉、NaCl、K2HPO4等6個因素進行篩選，每個因素設(shè)高低2個水平，實驗設(shè)計與結(jié)果如表1～2所示。

由回歸分析可知，大豆粉和葡萄糖是主要的影響因素，二者在大于95 %的概率水平上差異顯著。淀粉、酵母膏、NaCl、K2HPO4等4個因素在95 %的概率水平上差異不顯著，由此確定大豆粉和葡萄糖為主要因素進行下一步實驗。

2.2 RSA試驗結(jié)果與分析

在PB實驗回歸分析基礎(chǔ)上，采用STATISTICA 6.0軟件進行RSA試驗設(shè)計，對葡萄糖和大豆粉的配比進行優(yōu)化，實驗設(shè)計及結(jié)果如表3～4和圖1所示。

試驗結(jié)果表明：各因素之間有一定交互作用，二次方模型與上述結(jié)果的擬合較好(模型的R2>0.98)。各因素優(yōu)化的比例為葡萄糖1.59 %，大豆粉2.90 %。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮源篩選PB試驗設(shè)計與結(jié)果

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳氮源篩選試驗統(tǒng)計分析結(jié)果

表3 碳氮源濃度響應(yīng)面試驗設(shè)計及阿扎霉素產(chǎn)量測定結(jié)果

表4 碳氮源濃度響應(yīng)面試驗統(tǒng)計分析結(jié)果

圖1 響應(yīng)面分析法確定響應(yīng)最大值Fig.1 The maximum response value determined by RSA test

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化試驗結(jié)果與分析

菌株發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果表明(表5)：發(fā)酵溫度在24～36 ℃，隨著溫度提高阿扎霉素F HPLC效價先提高后下降，28 ℃時效價為最高。發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH在6.0～8.0，隨著pH升高阿扎霉素F HPLC效價先提高后下降，7.5時效價為最高。在500 mL三角瓶裝液量為50 mL時阿扎霉素F HPLC效價最高，隨著裝液量的增加效價逐漸下降；接種量分別以2 %、4 %、6 %、8 %、10 %接種，隨著接種量的增加阿扎霉素F HPLC效價逐漸提高。綜合考慮裝液量、通氣量和生產(chǎn)成本，適宜裝液量為100 mL/500 mL，接種量為10 %。阿扎霉素F在0～16 h時間段沒有合成，而在24～72 h時間段內(nèi)大量合成，并在72 h時HPLC效價達到最高值，之后逐漸下降，因此，確定菌株的發(fā)酵終點定為72 h。

表5 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

將一級種子接種到優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，于優(yōu)化的培養(yǎng)條件下發(fā)酵培養(yǎng)。不同時間取樣，測定阿扎霉素F HPLC效價、菌絲生物量及pH，試驗結(jié)果表6所示。48 h前，菌體處于指數(shù)生長期，發(fā)酵液pH一直下降；48 h后，菌體生長進入穩(wěn)定期，阿扎霉素F合成速度加快，在72 h HPLC效價達最高，為1950.26 μg/mL。隨著時間延長，阿扎霉素F HPLC效價呈下降趨勢，88 h發(fā)酵液pH值急劇上升，顯微鏡檢察發(fā)現(xiàn)菌體自溶。在優(yōu)化的發(fā)酵條件下，阿扎霉素F HPLC效價由原來的637.59 μg/mL上升到1950.26 μg/mL，HPLC效價提高約205.88 %(P<0.01)。

2.4 發(fā)酵罐放大發(fā)酵試驗結(jié)果與分析

50 L自動生物發(fā)酵罐驗證優(yōu)化條件試驗過程中，各階段阿扎霉素F含量和菌絲體沉降體積變化情況如表7所示。從上罐至18 h，菌體開始生長，整個過程中菌絲體積的變化呈現(xiàn)平緩增加的趨勢，阿扎霉素F從24 h時開始產(chǎn)生，到63 h時達到最高效價，為2094.12 μg /mL。

表7 發(fā)酵過程中阿扎霉素F和菌絲沉降體積結(jié)果

3 討 論

3.1 阿扎霉素 F類化合物農(nóng)抗應(yīng)用前景及存在問題

阿扎霉素F是一類含氧雜環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，文獻報道從S.hygroscopicusvar.azalornyceticus、S.hygroscopicusA1491、S.violaceusnigerRS-22、S.hygroscopicusMSU/IVIIV-4-75B、Actinomycetesp. HILY-9120362、S.malaysiensisECO-00002、S.malaysiensisMJM1968J 及S. sp. 211726等多種鏈霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物中先后發(fā)現(xiàn)了該類化合物，具有顯著的抗真菌、革蘭氏陽性菌和抗腫瘤活性，具備開發(fā)為高效農(nóng)用抗生素的潛力，但由于缺乏系統(tǒng)成藥基礎(chǔ)研究，導(dǎo)致下游開發(fā)形成瓶頸，截止目前尚未作為農(nóng)用抗生素在國內(nèi)登記使用[11-17]。馬來西亞鏈霉菌ECO 00002分離自云南省寧蒗縣土壤樣品產(chǎn)阿扎霉素新的野生型菌株，產(chǎn)率相對較低，通過選育優(yōu)良菌株或利用基因工程技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)菌株，結(jié)合現(xiàn)代發(fā)酵工程和代謝工程技術(shù)，優(yōu)化菌株定向發(fā)酵調(diào)控工藝，提高活性化合物阿扎霉素F的生產(chǎn)率，是實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的主要途徑。本研究結(jié)果表明，通過發(fā)酵條件優(yōu)化，可以顯著提高目標活性化合物阿扎霉素F的產(chǎn)率，而選育優(yōu)良菌株或利用基因工程技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)菌株是下一步需要重點開展的研究內(nèi)容。

3.2 阿扎霉素 F類化合物代謝調(diào)控的闡明對于菌株選育、遺傳改良和發(fā)酵優(yōu)化的指導(dǎo)作用

闡明阿扎霉素F類化合物的形成遺傳機制和生物合成過程是菌株選育和遺傳改良的基礎(chǔ)，也是菌株發(fā)酵條件優(yōu)化的前提。阿扎霉素F類化合物的生物合成是在復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)控作用下完成，調(diào)控因子通過不同的機制發(fā)揮其全局調(diào)控的作用[18]。因此，通過調(diào)節(jié)正調(diào)控因子可以提高化合物的產(chǎn)率，抑制負調(diào)控因子可以解除對化合物合成的抑制作用而實現(xiàn)提高產(chǎn)率的目的。阿扎霉素F系含氧雜環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，其生物合成是由包括酰基輔酶A活化羧酸等一系列多次重復(fù)的醇醛縮合反應(yīng)，催化形成具有一定長度的聚酮鏈骨架，然后該聚酮鏈骨架經(jīng)過環(huán)化，或者與脫氧糖等結(jié)構(gòu)單元連接而形成[5]。阿扎霉素B的生物合成機制是最先被闡明的阿扎霉素類化合物，該化合物具有一個非常稀有的C-2對稱結(jié)構(gòu)，屬于16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類化合物，其碳骨架主要來源于6個丙酸鹽、8個乙酸鹽和2個丁酸鹽，利用頭尾縮合式的聚酮類化合物的合成方式合成，其中包括來源于葡萄糖的2-脫氧巖藻糖，來源于丙酸鹽的3個甲基基團，結(jié)構(gòu)中糖苷配基中的氧原子來源于聚酮生物合成過程中的前體物質(zhì)[19]。而阿扎霉素F系列化合物的研究主要集中在活性測試和結(jié)構(gòu)鑒定等方面，生物合成機制尚未完全明確[20]，化合物代謝調(diào)控的闡明對于菌株選育、遺傳改良和發(fā)酵優(yōu)化的將具有重要的指導(dǎo)作用。

3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化對于阿扎霉素 F類化合物生物合成的影響

無機鹽、微量元素、生長因子、前體和抑制劑等培養(yǎng)基組成也是菌體生長繁殖和目標活性化合物的生物合成的重要影響因素。從阿扎素F類化合物生物合成途徑及與其相關(guān)的代謝途徑出發(fā)，篩選促進化合物生物合成的影響因素是提高產(chǎn)率的另一重要途徑。

4 結(jié) 論

馬來西亞鏈霉菌ECO 00002發(fā)酵培養(yǎng)基中主要的影響因素為大豆粉和葡萄糖，其最大響應(yīng)值分別為2.90 %和1.59 %；優(yōu)化的發(fā)酵條件為初始pH 7.5，裝液量100 mL/500 mL，接種量為10 %，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時間72 h。在優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件下，搖瓶水平上阿扎霉素F HPLC效價由原來的637.59 μg/mL上升到1950.26 μg/mL，HPLC效價提高率為205.88 %(P<0.01)；100 L發(fā)酵罐阿扎霉素F的HPLC效價為2094.12 μg /mL，阿扎霉素F類化合物的HPLC效價大幅度提高。