葉春秀，趙曾強，田又升，王志軍，于 航，莊振剛，謝宗銘

(1.新疆農(nóng)墾科學院/作物種植創(chuàng)新與基因資源利用兵團重點實驗室，新疆 石河子 832000；2.新疆農(nóng)業(yè)大學，新疆 烏魯木齊 830000)

【研究意義】新疆屬于典型的灌溉農(nóng)業(yè)，年降水量在200 mm以下，農(nóng)業(yè)用水資源主要為雪山融水和地下水，水資源匱乏和利用水平低下成為新疆農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要限制因子[1]。棉花是新疆重要的經(jīng)濟作物之一。生物(病蟲害等)和非生物脅迫(干旱、低溫等)是新疆棉花生產(chǎn)穩(wěn)定發(fā)展的主要限制因素。當前棉花育種的主要目標是早熟、抗逆、適宜機械采收，但限于現(xiàn)有種質(zhì)資源和傳統(tǒng)育種手段，難以選育出適應(yīng)當前生產(chǎn)急需的棉花品種。因此，迫切需要在種質(zhì)資源和育種新技術(shù)方面有盡快突破?，F(xiàn)代分子生物學技術(shù)的發(fā)展，特別是分子標記輔助選擇技術(shù)的日益成熟，為棉花育種提供了強有力手段。國外種質(zhì)資源的引進和再創(chuàng)新利用是解決新疆棉花種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)狹窄和新品種選育的重要途徑?！厩叭搜芯窟M展】吾買爾江.庫爾班[1]等對收集引進的64份國外(美國46份、前蘇聯(lián)5份、澳大利亞12份、墨西哥1份)陸地棉材料進行連續(xù)3年的纖維品質(zhì)穩(wěn)定性及衣分變化規(guī)律的初步研究，表明在新疆南疆氣候條件下引進種質(zhì)纖維長度、伸長率的穩(wěn)定性比較好，其它纖維性狀不同程度地發(fā)生變化；衣分表現(xiàn)為逐年增高的趨勢，這些材料的收集和鑒定對新疆棉花育種工作具有重要的意義。Alisher Abdullaev[2]等詳細介紹說明了烏茲別克斯坦棉花種質(zhì)資源收集歷史、過程及當前面臨的挑戰(zhàn)，為我國棉花種質(zhì)資源工作者提供豐富的烏茲別克斯坦的棉花種質(zhì)信息和收集情況。師維軍等[3]對收集引進的100份國外陸地棉種質(zhì)資源材料在新疆特定生態(tài)條件下的主要農(nóng)藝性狀、生物學性狀、纖維品質(zhì)、抗病性、抗蟲性等方面的表現(xiàn)情況做了研究，篩選出一批具有一定利用價值的材料，促進新疆棉花種質(zhì)資源及育種工作的開展?！颈狙芯壳腥朦c】面對新疆棉花生產(chǎn)進一步發(fā)展的需要，從種質(zhì)資源研究角度來說，一方面加強種質(zhì)資源材料的收集引進工作，尤其是國外材料的收集引進具有重要意義，另一方面對引進種質(zhì)在新疆地區(qū)適應(yīng)性、抗逆性等方面進行鑒定對種質(zhì)資源的評價和利用具有深遠意義。【擬解決的關(guān)鍵問題】本文通過對烏茲別克斯坦引進的種質(zhì)資源進行抗旱性評價，并篩選相關(guān)的分子標記，為開展棉花多抗、宜機采種質(zhì)資源創(chuàng)新和新品種選育奠定技術(shù)和基因資源基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗以從烏方引進棉花種質(zhì)資源7份種質(zhì)資源為研究材料，材料名稱分別為：引2、引4、引20、引23、引22(紅莖)、引22、引2(抗旱)。

1.2 試驗方法

實驗材料為水培培養(yǎng)，于材料長出6片真葉時采用PEG進行處理，分別采集處理0，2，4，6，8 d的葉片，錫箔紙包裝，液氮速凍保存，每份材料取樣3份用于后期生理生化指標測定。測定的生理生化指標包括SOD(超氧化物歧化酶)、POD(過氧化物酶)、CAT(過氧化氫酶)活性分析、MDA(丙二醛)含量、超氧陰離子含量、可溶性蛋白含量、APX(抗壞血酸過氧化物酶)等。其中SOD測定采用氮藍四唑(NBT)光化還原法測定[4]；POD采用愈創(chuàng)木酚法測定[5]；CAT活性參照田又升等[6-7]方法；MDA含量采用硫代巴比妥酸法[4]、超氧陰離子含量測定參照Elstner等[8]方法；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250法測定[9]。

1.3 抗旱分子標記篩選

通過查閱相關(guān)文獻，初步合成了8對抗旱性SSR標記，具體序列如表1。

由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為20 μl，包含10×Buffer(含Mg2+)2.0 μl，dNTP 0.4 μl，引物2 μl，TaqDNA聚合酶0.2 μl (5 U/L)，模板DNA 2 μl，其余用ddH2O補充至20 μl。擴增程序為95 ℃預變性3 min，94 ℃變性50 s，55 ℃復性45 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR反應(yīng)在PCR儀中進行。擴增產(chǎn)物先在40 g/L的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，相機拍照、保存和計數(shù)1.4 數(shù)據(jù)分析。

實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2013進行整理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引進種質(zhì)干旱處理POD、CAT活性變化趨勢

由圖1可以看出，所有種質(zhì)在干旱處理后，POD活性都呈上升趨勢，但種質(zhì)引4、引2(抗旱)、引22在干旱處理整個過程POD活性顯著高于其它4個種質(zhì)，根據(jù)相關(guān)參考文獻初步推斷種質(zhì)引4、引2(抗旱)、引22較其它種質(zhì)耐旱。所有種質(zhì)在干旱處理后，CAT活性變化趨勢存在差異，其中種質(zhì)引4、引20、引23在整個干旱處理過程CAT活性變化呈先上升，后下降的波動趨勢；種質(zhì)引22、引22(紅莖)、引2、引2(抗旱)CAT活性變化從處理2 d后幾乎都呈下降趨勢，根據(jù)相關(guān)參考文獻初步推斷種質(zhì)引4、引20、引23較其它種質(zhì)耐旱。

表1 引進種質(zhì)抗旱性分子標記篩選引物序列

圖1 引進種質(zhì)干旱處理POD、CAT活性變化趨勢Fig.1 The trend of POD and SOD activities

圖2 引進種質(zhì)干旱處理MDA、超氧陰離子含量變化趨勢Fig.2 The trend of MDA and superoxide content

2.2 引進種質(zhì)干旱處理MDA、超氧陰離子含量變化趨勢

由圖2可以看出，所有種質(zhì)在干旱處理后，MDA含量變化趨勢在整個干旱處理過程中幾乎一致(先上升后下降)，不存在顯著的差異性。所有種質(zhì)在干旱處理后，超氧陰離子含量變化趨勢存在差異，其中種質(zhì)引4、引20、引22、引23超氧陰離子含量變化呈持續(xù)上升趨勢，直至處理8 d所有種質(zhì)含量無明顯差異；而種質(zhì)引22(紅莖)、引2、引2(抗旱)超氧陰離子含量變化在整個過程中呈持續(xù)下降的趨勢，根據(jù)相關(guān)參考文獻初步推斷，種質(zhì)引4、引20、引22、引23較其它3份種質(zhì)耐旱。

2.3 引進種質(zhì)干旱處理可溶性蛋白含量、APX(抗壞血酸過氧化物酶)變化趨勢

由圖3可以看出，所有種質(zhì)在干旱處理后，可溶性蛋白含量變化趨勢存在差異，其中種質(zhì)引2、引4、引20、引23可溶性蛋白含量變化呈持續(xù)上升趨勢，直至處理8 d所有種質(zhì)含量無明顯差異；而種質(zhì)引22(紅莖)、引22、引2(抗旱)可溶性蛋白含量在整個過程中呈持續(xù)下降趨勢，根據(jù)相關(guān)參考文獻初步推斷，種質(zhì)引2、引4、引20、引23較其它3份種質(zhì)耐旱。

所有種質(zhì)在干旱處理后，APX活性變化趨勢差異不明顯，其中只有種質(zhì)引23的APX活性在處理2 d時急劇上升，為其它種質(zhì)APX活性的4倍，而其它種質(zhì)在干旱處理的整個過程APX活性變化趨勢幾乎一致，初步說明APX活性不能很好地作為鑒定引進種質(zhì)抗旱性的指標。

圖3 引進種質(zhì)干旱處理可溶性蛋白含量、APX(抗壞血酸過氧化物酶)變化趨勢圖Fig.3 The trend of APX and protein content

圖4 引進種質(zhì)抗旱性相關(guān)標記篩選Fig.4 Molecular marker related to drought

2.4 引進材料的抗旱性相關(guān)分子標記篩選

通過篩選最終有2對引物在引進種質(zhì)之間有差異條帶，將標記篩選結(jié)果與生理生化指標鑒定結(jié)果進行對比，發(fā)現(xiàn)引物B擴增結(jié)果與其具有一致性，其中耐旱種質(zhì)引4、引20、引23、引22紅能夠得到與其它3份種質(zhì)不同的擴增條帶(圖4)，多出1條擴增條帶，初步分析該引物可能是與耐旱性相關(guān)的標記。

3 討 論

棉花種質(zhì)資源的收集、研究和利用收到世界各產(chǎn)棉國的高度重視，豐富的種質(zhì)資源和遺傳多樣性是培育優(yōu)良品種的必要條件，通過引進各類豐富的種質(zhì)資源是拓展種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)的有效方法，同時對引進材料進行農(nóng)藝性狀、抗逆性等方面的鑒定，可以為棉花育種提供豐富、有用的親本材料，加快育種進程[11-14]。張香桂等[15]為了有效利用引進的的棉花種質(zhì)資源，對引進國外的154份種質(zhì)材料進行主要農(nóng)藝和經(jīng)濟性狀研究，發(fā)現(xiàn)引進的材料類型較為豐富，具有選用矮桿、高籽指、高強纖維材料的潛力，同時具有較強的改良產(chǎn)量因素的潛力。劉少卿等[16]通過對引進的200份棉花種質(zhì)耐熱性進行鑒定，篩選出了高溫耐熱性種質(zhì)，用于育種和基礎(chǔ)研究中。朱竹青等[17]對來自中國、美國、法國等國家的114份棉花種質(zhì)資源進行了生育、產(chǎn)量性狀、纖維品質(zhì)及抗黃萎病、棉鈴蟲性鑒定，結(jié)果表明這些資源具有較強的生育性狀選擇潛力，篩選出一批具有不同優(yōu)異性狀的種質(zhì)材料，為棉花育種中有目的利用材料提供了參考。趙麗芬等[18]對引進巴基斯坦的54份棉花種質(zhì)材料進行田間鑒定，結(jié)果表明引進的種質(zhì)類型豐富，在抗高溫、抗病、改良纖維品質(zhì)和提高產(chǎn)量等方面具有較高利用價值。

4 結(jié) 論

本研究通過對引進種質(zhì)抗旱性相關(guān)指標的測定，推斷在引進的幾份種質(zhì)中，種質(zhì)引4、引20、引23耐旱性較強，種質(zhì)引22稍弱，其它種質(zhì)屬于干旱敏感型材料，能夠?qū)⒔Y(jié)果用于實際育種過程中，同時抗旱相關(guān)分子標記的篩選能夠為分子標記輔助育種提供鑒定方法和應(yīng)用。