卿冬進(jìn)，劉開(kāi)強(qiáng)，鄧國(guó)富，高利軍，黃 娟，高 菊，伍 豪，戴高興，梁海福，周維永*

(1. 廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007；2. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 廣西 南寧 530007；3. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】水稻作為重要的糧食作物之一，是世界上約50 %人口的主食。水稻產(chǎn)量與品質(zhì)性狀存在負(fù)相關(guān)的關(guān)系，因此同時(shí)提高產(chǎn)量和品質(zhì)是目前水稻育種研究者面臨的一個(gè)重要的挑戰(zhàn)性問(wèn)題[1]。谷粒大小是影響稻米產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一，因此對(duì)谷粒形狀的改良是水稻育種的主要目標(biāo)之一。在中國(guó)南方高溫地區(qū)，谷粒越寬灌漿越難，從而造成米質(zhì)下降。據(jù)報(bào)道，粒寬負(fù)調(diào)控基因GW8的功能缺失可使谷粒粒寬變窄，易灌漿，米質(zhì)也隨之提高[2]。因此，建立GW8基因的熒光分子標(biāo)記并用于分子標(biāo)記輔助選擇育種對(duì)水稻米質(zhì)改良有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前為止，已有400多個(gè)與水稻粒型相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)(Quantitative Trait Loci, QTL)被定位，已有60個(gè)與水稻粒型相關(guān)的基因被克隆[3]，如GW2[4]、GW5/qSW5[5-7]、TGW6[8]、GL7/GW7/SLG7[9-11]、GW8[2]、GS3[12]、GL3.1/qGL3[13-15]、GS5[16-17]及GS6[18]等。這些粒型相關(guān)基因涉及復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從調(diào)控細(xì)胞伸長(zhǎng)或增殖開(kāi)始，至籽粒灌漿過(guò)程結(jié)束為止[19-20]。部分已克隆的水稻粒型相關(guān)基因的分子標(biāo)記已經(jīng)被開(kāi)發(fā)及應(yīng)用，裔傳燈等[21-22]通過(guò)分析GS3基因序列與GS5基因序列，分別開(kāi)發(fā)了其功能標(biāo)記，并利用所開(kāi)發(fā)的2個(gè)分子標(biāo)記分別鑒定了294份水稻微核心種質(zhì)和2007-2013年江蘇省審定的65份粳稻品種基因型。Wang等[2]發(fā)現(xiàn)水稻品種華粳秈74中重要粒型基因GW8在的啟動(dòng)子上有10 bp序列(GAGCTGAGCT)存在，其對(duì)該基因在幼穗中正常表達(dá)有重要調(diào)節(jié)作用，增加了谷粒粒寬；而GW8基因在Basmati 385中的啟動(dòng)子區(qū)缺失10 bp序列，引起基因下調(diào)表達(dá)，谷粒粒寬變窄，使稻米的外觀品質(zhì)提高。裔傳燈等[23]根據(jù)GW8基因啟動(dòng)子10 bp的Indel及第3外顯子A/C和T/G的變異位點(diǎn)分別開(kāi)發(fā)功能標(biāo)記，并對(duì)294份水稻微核心種質(zhì)和65份粳稻品種進(jìn)行了基因型鑒定，結(jié)果證明了這3個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)稻谷粒型有重要的影響?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】PARMS(Penta-primer amplification refractory mutation system)技術(shù)，是基于擴(kuò)增受阻突變的體系PCR(ARMS-PCR)技術(shù)[24]，并在此基礎(chǔ)上增加兩條不同熒光標(biāo)記引物，通過(guò)不同的熒光信號(hào)檢測(cè)基因的多態(tài)性。卿冬進(jìn)等[25]利用該技術(shù)開(kāi)發(fā)了水稻抗稻瘟病基因Pigm的熒光分子標(biāo)記并驗(yàn)證其可靠性。本研究利用該技術(shù)開(kāi)發(fā)GW8基因熒光分子標(biāo)記，GW8基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)熒光掃描、軟件分析直接獲得基因分型結(jié)果，擺脫了瓊脂糖和PAGE電泳分析的費(fèi)時(shí)工作。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用廣西細(xì)粒優(yōu)質(zhì)雜交稻親本材料美B與5個(gè)寬粒秈稻品種中GW8基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)美B的GW8第二內(nèi)含子存在2個(gè)堿基缺失差異，因此開(kāi)發(fā)其熒光分子標(biāo)記，通過(guò)對(duì)42份秈稻親本材料進(jìn)行基因分型，并結(jié)合粒寬表型分析，證明該熒光分子標(biāo)記的有效性。GW8基因熒光分子標(biāo)記的建立為利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)跟蹤該基因改良谷粒粒寬農(nóng)藝性狀提供了高效、可靠的基因分型技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻材料為廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室提供的42份秈稻親本材料(表1)。

表2 GW8基因標(biāo)記引物序列

1.2 谷粒寬的測(cè)量

在42份供試材料中分別選取具有代表性表型的谷粒10粒，并利用SC-G型自動(dòng)種子考種及千粒重分析儀(萬(wàn)深檢測(cè)科技公司，中國(guó))進(jìn)行粒寬測(cè)量。

1.3 水稻葉片DNA的提取

2018年5月25日，采取種植于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院里建基地水稻田的42個(gè)秈稻親本材料葉片，參考Murray等[26]的CTAB法提取水稻葉片的DNA。提取的DNA溶入1×TE緩沖液作為PCR擴(kuò)增模板。

1.4 GW8基因的PCR擴(kuò)增

參考卿冬進(jìn)等[25]的方法對(duì)上述42份秈稻親本材料的GW8基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為10 μl，其中包含：2×PARMS master mix 5 μl，10 mmol/L正向標(biāo)記引物(Allele-AT) 0.15 μl，10 mmol/L正向標(biāo)記引物(Allele-GC)0.15 μl，10 mmol/L通用反向標(biāo)記引物(Common-R)0.15 μl，模板DNA(10～100 ng)1 μl， ddH2O 3.55 μl。PCR反應(yīng)程序：95 ℃，5 min；95 ℃，20 s，65 ℃(-0.8 ℃/循環(huán))，1 min，10個(gè)循環(huán)；95 ℃，20 s，57 ℃，1 min，32個(gè)循環(huán)。標(biāo)記引物序列見(jiàn)表2。

1.5 基因分型鑒定

采用HEX、FAM和ROX三通道熒光掃描酶標(biāo)儀(Tecan Infinite F200，瑞士)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)強(qiáng)度，然后將熒光信號(hào)值在網(wǎng)頁(yè)(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)上用SNP decoder軟件分析樣品PCR擴(kuò)增的FAM和HEX熒光信號(hào)值，并用散點(diǎn)圖格式輸出，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因分型，如檢測(cè)到FAM熒光信號(hào)的為2堿基缺失的GW8等位基因型，檢測(cè)到HEX熒光信號(hào)的為不存在2堿基缺失的GW8等位基因型，同時(shí)檢測(cè)到FAM和HEX的則為雜合基因型，熒光信號(hào)類(lèi)型與基因型關(guān)系見(jiàn)表3。

表3GW8等位基因與熒光標(biāo)記對(duì)應(yīng)表

Table 3 Corresponding relation table ofGW8 alleles and fluorescence marker

基因名稱(chēng)Gene name熒光類(lèi)型Fluorescence type等位基因型Genotype of allelesGW8FAM--ATHEXGCAT

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

利用ClustalX軟件對(duì)GW8基因序列進(jìn)行等位分析；用Photoshop 7.0進(jìn)行圖像處理及制圖；用JMP 11.0 軟件的t檢驗(yàn)對(duì)粒寬數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GW8熒光分子標(biāo)記引物設(shè)計(jì)

根據(jù)廣西細(xì)粒優(yōu)質(zhì)秈稻保持系親本材料美B中GW8基因序列與5個(gè)谷粒較寬的秈稻保持系親本(美B、汕B、博IIIB、II-32B、深95B和宇19B)序列比對(duì)，其中美B中有2個(gè)堿基缺失(圖1)，利用該InDel差異性為特異性引物的3’末端，設(shè)計(jì)共顯性的分子標(biāo)記PM-GW8。分子標(biāo)記引物Allele-AT能與PARMS master mix中帶FAM熒光的引物匹配，而Allele-GC可以與PARMS master mix中帶HEX熒光的引物匹配，根據(jù)PCR擴(kuò)增后獲得不同的熒光信號(hào)而鑒定到不同的基因型。根據(jù)序列的SNP對(duì)比分析結(jié)果，預(yù)測(cè)PCR擴(kuò)增后，美B中的GW8基因的擴(kuò)增產(chǎn)物可以鑒定到FAM熒光信號(hào)，而其他5個(gè)秈稻保持系親本材料的等位基因擴(kuò)增后可以鑒定到HEX熒光信號(hào)，因此，谷粒較窄的美B中的GW8基因型可與其他谷粒較寬品種中的GW8基因型區(qū)分開(kāi)。

圖1 GW8基因中用于標(biāo)記開(kāi)發(fā)的序列等位分析結(jié)果Fig.1 Allelic analysis result of GW8 gene for maker development

圖2 PM-GW8 對(duì)42份秈稻親本的基因分型檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Genotyping result of 42 indica rice germplasms by using PM-GW8

2.2 分子標(biāo)記PM-GW8檢測(cè)GW8及等位基因在42份秈稻親本中的分布

利用建立的熒光分子標(biāo)記PM-GW8檢測(cè)42份秈稻親本材料的基因型，經(jīng)PCR擴(kuò)增、熒光掃描及其熒光信號(hào)分析軟件處理后，分析結(jié)果顯示僅在谷粒較窄的美B中檢測(cè)到FAM熒光信號(hào)，而其他41份秈稻親本材料中則檢測(cè)到HEX熒光信號(hào)(圖2)。根據(jù)該分子標(biāo)記引物設(shè)計(jì)原理及其不同的熒光信號(hào)強(qiáng)度值進(jìn)行分析，結(jié)果表明美B中存在的GW8谷粒較窄的等位基因型為純合“--AT”，其他41份秈稻親本材料中沒(méi)有檢測(cè)到FAM熒光信號(hào)，但檢測(cè)到HEX熒光信號(hào)，其等位基因型為純合“GCAT”。

圖3 用于分子標(biāo)記設(shè)計(jì)的6份秈稻親本谷粒表型Fig.3 Grain phenotype of six indica rice germplasms for molecular marker design

2.3 秈稻親本材料的粒型分析

對(duì)本研究中用于序列分析設(shè)計(jì)熒光分子標(biāo)記的6個(gè)秈稻品種親本材料進(jìn)行粒寬測(cè)量，結(jié)果顯示帶有GW8“--AT”基因型的美B粒寬較窄，而帶有GW8“GCAT”基因型的汕B、博IIIB、II-32B、深95B和宇19B粒寬較寬(圖3)。t檢驗(yàn)結(jié)果顯示美B的粒寬與汕B、博IIIB、II-32B、深95B和宇19B相比，差異達(dá)顯著水平(P<0.05，下同，表4)。對(duì)其他36份秈稻親本材料進(jìn)行粒寬測(cè)量，分析結(jié)果顯示36份秈稻材料的粒寬都大于美B，其中有35份秈稻品種與美B之間存在顯著差異(表4)。

表4 秈稻親本材料的粒寬及PM-GW8分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

續(xù)表4 Continued table 4

編號(hào)Number品種名稱(chēng)Variety粒寬(mm)Grain widthGW8基因型Genotype of GW816金23B2.55±0.08?GCAT17博B2.55±0.11?GCAT18泰豐B2.39±0.13GCAT19岳4B2.60±0.09?GCAT20崗46B3.42±0.09?GCAT21華2048B3.50±0.14?GCAT22恒豐B2.66±0.14?GCAT23112B2.86±0.14?GCAT24天豐B2.73±0.12?GCAT25多系一號(hào)2.68±0.14?GCAT26R7742.86±0.07?GCAT27桂992.65±0.05?GCAT28R2732.70±0.07?GCAT29R7953.18±0.08?GCAT30R75712.89±0.10?GCAT31輻恢8383.48±0.14?GCAT32R5273.02±0.11?GCAT33R7892.56±0.05?GCAT34華占2.57±0.08?GCAT35138R2.52±0.88?GCAT36測(cè)2532.79±0.12?GCAT37桂紅1號(hào)2.52±0.11?GCAT38B3243.09±0.09?GCAT39谷梅4號(hào)3.44±0.07?GCAT40金圍矮3.32±0.14?GCAT41GW23.12±0.16?GCAT42龍豐B2.64±0.06?GCAT

注：“--AT”和“GCAT”分別代表GW8等位基因FAM熒光信號(hào)及HEX熒光信號(hào)；*表示經(jīng)t檢驗(yàn)，其他品種粒寬與美B差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

Note: ‘--AT’ and ‘GCAT’ indicate FAM fluorescence and HEX fluorescence ofGW8 allele, respectively. * indicates significant difference between the grain width of meiB and that of other varieties byt-test(P<0.05).

3 討 論

籽粒是水稻光合作用產(chǎn)物的重要貯存器官。水稻粒型與產(chǎn)量、品質(zhì)有直接關(guān)系，特別是在我國(guó)南方地區(qū)，高溫逼熟造成籽粒較寬品種的稻米堊白粒率較高，影響外觀品質(zhì)。一般細(xì)長(zhǎng)粒稻米的堊白率較低，其外觀品質(zhì)也較好[27]。本研究根據(jù)廣西優(yōu)質(zhì)雜交稻親本保持系材料美B的籽粒粒寬較窄的特征，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)該品種的GW8基因有2個(gè)堿基缺失，由此利用該InDel位點(diǎn)設(shè)計(jì)熒光分子標(biāo)記，且通過(guò)DNA序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)Wang等[2]已報(bào)道的GW8基因的該缺失位點(diǎn)在水稻品種Basmati中存在。雖然2個(gè)堿基缺失的InDel位點(diǎn)與裔傳燈等[23]的研究中用于開(kāi)發(fā)GW8功能標(biāo)記的3個(gè)變異位點(diǎn)不同，但該變異位點(diǎn)也是與谷粒寬的表型性狀連鎖在一起，因此可用于開(kāi)發(fā)其分子標(biāo)記來(lái)跟蹤GW8等位基因，改良谷粒寬的農(nóng)藝性狀。

分子生物學(xué)技術(shù)在水稻研究上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，與水稻產(chǎn)量、品質(zhì)相關(guān)的粒型基因不斷被克隆，但是這些功能基因在水稻育種應(yīng)用上還很少，其主要受制于開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記成本高、等位變異類(lèi)型多樣化等。目前分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)已廣泛應(yīng)用于作物育種工作中，其優(yōu)點(diǎn)是能夠快速、精準(zhǔn)跟蹤目標(biāo)基因，且不受環(huán)境因素的影響[28]。目前已報(bào)道的GW8基因分子標(biāo)記尚少，裔傳燈等[23]根據(jù)GW8的變異位點(diǎn)開(kāi)發(fā)了分子標(biāo)記，并對(duì)294份水稻微核心種質(zhì)進(jìn)行基因型鑒定，發(fā)現(xiàn)存在的8種單體型對(duì)水稻粒型性狀有極其顯著的影響。本研究主要利用PARMS技術(shù)開(kāi)發(fā)了GW8基因的熒光分子標(biāo)記PM-GW8，用于分子標(biāo)記輔助育種，以區(qū)分寬粒和窄粒品種的GW8基因型。該分子標(biāo)記能精確檢測(cè)到秈稻親本美B中存在2個(gè)堿基缺失的GW8等位基因，與普通的GW8分子標(biāo)記相比，具有不需要進(jìn)行DNA電泳的分析的簡(jiǎn)便性，通過(guò)熒光信號(hào)掃描和軟件分析直接獲得基因型，也可同時(shí)對(duì)大規(guī)模水稻品種的GW8基因進(jìn)行高通量的基因分型。

水稻粒寬表型受GW8[2]、GW5[5-7]和WTG1[29]等多個(gè)基因的調(diào)控，GW8基因調(diào)控粒寬變化過(guò)程中，其他相關(guān)基因也會(huì)同時(shí)參與調(diào)控，影響粒寬的變化程度。本研究通過(guò)對(duì)42份秈稻親本谷粒進(jìn)行粒寬測(cè)量，發(fā)現(xiàn)泰豐B的粒寬與美B相比差異不顯著，可能是由于泰豐B中存在的GW5及WTG1等相關(guān)基因?qū)α挼恼{(diào)控作用造成了影響，導(dǎo)致GW8基因的調(diào)控效率降低。本研究利用PM-GW8熒光分子標(biāo)記對(duì)秈稻親本材料進(jìn)行基因型檢測(cè)，并結(jié)合谷粒粒寬測(cè)量試驗(yàn)，證明了該熒光分子標(biāo)記的有效性，為利用GW8基因改良谷粒粒寬農(nóng)藝性狀提供了一種新的基因分型檢測(cè)方法。但為了精準(zhǔn)改良水稻粒型，提高水稻產(chǎn)量和品質(zhì)，對(duì)利于粒型改良的相關(guān)基因資源還需進(jìn)一步加強(qiáng)挖掘和利用，開(kāi)發(fā)更多的分子標(biāo)記，推動(dòng)分子育種研究工作的發(fā)展。

4 結(jié) 論

運(yùn)用PARMS方法結(jié)合水稻粒寬調(diào)控基因GW8的等位分析，開(kāi)發(fā)了GW8基因熒光分子標(biāo)記PM-GW8，并證明了該分子標(biāo)記能夠快速、有效地鑒定水稻中GW8的“--AT”和“GCAT”基因型，為利用分子標(biāo)記跟蹤GW8基因、改良水稻粒寬性狀提供了基因分型新技術(shù)。