王荃 石雨鷺 邳瑞雪 孔曉聰 靳亞軍 梁閃閃 張泗舉 欒維江

（天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/天津市動植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387；第一作者：wanghanmada＠163．com；*通訊作者：lwjzsq＠163．com）

未知功能結(jié)構(gòu)域蛋白家族（domains of unknown function protein families，DUFs）是一大群功能未知的蛋白家族。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，大約3 700多個(gè)未知功能結(jié)構(gòu)域蛋白家族存在于蛋白家族（Pfam27．0版）數(shù)據(jù)庫中，占據(jù)了整個(gè)蛋白家族的25%左右[1]。大量轉(zhuǎn)錄譜和蛋白譜分析顯示，DUFs蛋白對生物的生長發(fā)育發(fā)揮著重要作用。對這些基因的研究將有助于對生物體復(fù)雜的生命活動進(jìn)行更深入的了解[2]。在植物中，DUF家族成員的功能報(bào)道較少。目前已有的DUFs基因生物學(xué)功能研究主要集中在模式植物擬南芥和水稻中。根據(jù)已有研究發(fā)現(xiàn)，DUFs家族基因與植物的生長發(fā)育及非生物脅迫應(yīng)答密切相關(guān)。在擬南芥中，DUF784家族基因能夠調(diào)控花粉發(fā)育，利用RNAi技術(shù)降低擬南芥DUF784家族基因的表達(dá)水平，在RNAi轉(zhuǎn)基因株系中出現(xiàn)胚珠敗育的表型[3]。DUF579家族基因IRX15和IRX15-L參與半纖維木聚糖的合成，影響擬南芥次生細(xì)胞壁形成[4]。擬南芥DUF642家族基因DGR1和DGR2參與了擬南芥對抗壞血酸合成末端前體L－GalL的響應(yīng)，并互補(bǔ)表達(dá)影響著擬南芥葉的擴(kuò)展和根的伸長[5]。擬南芥硫氧還蛋白DCC1屬于DUF393家族，定位于線粒體中，在愈傷組織中表達(dá)較高。它可以通過氧化還原調(diào)節(jié)ROS穩(wěn)態(tài)平衡進(jìn)而調(diào)節(jié)擬南芥的芽再生過程[6]。已報(bào)道的水稻DUF966家族成員OsDSR2的表達(dá)明顯受到干旱、高鹽等非生物脅迫條件的抑制[7]，該基因的過表達(dá)增強(qiáng)了水稻對PEG6000和高鹽脅迫的敏感性。水稻DUF1644家族基因OsSIDP409的超量表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因植株的抗氧化脅迫能力，提高了植株的耐鹽性[8]。水稻幼小花序和小穗的內(nèi)外稃中DUF640家族基因BSG1強(qiáng)烈表達(dá)，它對水稻的內(nèi)外稃發(fā)育、籽粒形狀和大小都起著正調(diào)控作用[9]。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)已廣泛的應(yīng)用于基因功能研究中，通過該技術(shù)可以對基因組DNA進(jìn)行編輯，創(chuàng)建突變體，從而進(jìn)行基因功能的研究。1987年，日本大阪大學(xué)的實(shí)驗(yàn)室在研究大腸桿菌的堿性磷酸酶基因時(shí)發(fā)現(xiàn)該基因編碼區(qū)下游存在一段串聯(lián)間隔重復(fù)序列，該序列包括14個(gè)29 bp的重復(fù)片段和32～33 bp的間隔序列[10]。2002年，MOJICA等[11]將含有該特點(diǎn)的序列命名為Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）。2005年發(fā)現(xiàn)，這類重復(fù)結(jié)構(gòu)廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中，預(yù)測其來源是原核生物在進(jìn)化過程中針對噬菌體等外源基因的獲得性免疫防御機(jī)制[12]，該系統(tǒng)簡稱為CRISPR/Cas9系統(tǒng)。根據(jù)結(jié)構(gòu)不同，CRISPR/Cas9系統(tǒng)分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3種不同類型[13]。現(xiàn)在最簡單、應(yīng)用最廣泛的是Ⅱ型。該系統(tǒng)由3部分組成：Cas9核酸酶、前體crRNA（pre－crRNA）和反式激活 crRNA（tracrRNA）。tracrRNA與pre－crRNA的重復(fù)序列配對，引導(dǎo)pre－crRNA加工，生成crRNA－tracrRNA復(fù)合體。在前端20 bp靶點(diǎn)序列的引導(dǎo)下，Cas9蛋白特異切割目的序列。2013年，CONG等[14]首次報(bào)導(dǎo)該系統(tǒng)定點(diǎn)突變?nèi)祟?93T細(xì)胞EMX1和OPVALB基因及小鼠細(xì)胞的Th基因，其在基因組進(jìn)行特異性切割。之后CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功應(yīng)用于家蠶、果蠅、酵母、斑馬魚等多個(gè)物種的內(nèi)源基因定點(diǎn)編輯[15]。高彩霞等[16]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對水稻中OsPDS、OsBADH2、OsMPK2和Os02g23823等4個(gè)基因的定點(diǎn)突變，水稻轉(zhuǎn)基因植株中的突變率為4．0%～9．4%，證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠用于植物基因組編輯。后來眾多科學(xué)家對該系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，并高效用于水稻的基因編輯中[17－20]。

為了揭示水稻中DUF家族基因的功能，本文利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了水稻 DUF家族成員Os－DUF393的編輯載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法[21]，獲得一系列穩(wěn)定遺傳的OsDUF393基因編輯突變體，并通過測序?qū)ζ渫蛔冾愋瓦M(jìn)行分析，為探究水稻OsDUF393基因功能提供研究材料。

1 材料與方法

1.1 材料

以粳稻品種中花11和轉(zhuǎn)基因材料用于本實(shí)驗(yàn)。所有材料種植于天津師范大學(xué)試驗(yàn)田及海南陵水南繁基地，田間保持常規(guī)管理。

1.2 靶向編輯位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)

利用 NCBI（http://www．ncbi．nlm．nih．gov/）數(shù)據(jù)庫查詢OsDUF393基因及蛋白序列，并用E－CRISPR網(wǎng)絡(luò)軟件預(yù)測目的基因的打靶效率，在目的基因的編碼區(qū)中查找符合GN（19）NGG的序列作為編輯的靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)在基因OsDUF393的第1個(gè)外顯子和第2個(gè)外顯子各設(shè)計(jì)1個(gè)靶點(diǎn)，并對設(shè)計(jì)的2個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行BLAST比對，保證其特異性。2個(gè)靶點(diǎn)的引物序列為DUFC1F：5 "－GTGTGGCGAGCTCGCTGGCACGCA －3 "；DUFC1R：5 "－AAACTGCGTGCCAGCGAGCTCGCC －3 "；DUFC2F：5 "－GTGTGTTCACTCTGACGTCAAAGT －3 "；DUFC2R：5 "－AAACACTTTGACGTCAGAGTGAAC－3 "。

1.3 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建

將合成的正反向引物各取10 uL混至1個(gè)管，放入PCR儀中退火。將退火產(chǎn)物進(jìn)行回收后與用BbsⅠ酶切的Os－U6SK質(zhì)粒骨架過夜連接獲得sgRNA重組載體，并對重組載體進(jìn)行PCR鑒定，所用特異引物分別為：M13F與靶點(diǎn)序列下游引物 DUF393－C1R和M13F與靶序列下游引物DUF393－C2R。將獲得的sgRNA融合載體及含有Cas9的Cas9－sk空載體分別用載體相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，回收酶切產(chǎn)物并將其連接到pCAMBIA1300雙元載體中，獲得重組載體。

1.4 轉(zhuǎn)基因植株的獲得及分子鑒定

將構(gòu)建的重組雙元載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得轉(zhuǎn)基因植株。待轉(zhuǎn)基因植株移至大田，收集轉(zhuǎn)基因植株葉片，用CTAB法提取水稻基因組DNA[22]，以載體中選擇標(biāo)記潮霉素特異性hygF/R引物對其進(jìn)行PCR分子鑒定，引物序列為hygF：5 "－GGAGCATATACGCCCGGAGT－3 "；hygR：5 "－GTTTATC GGCACTTTGCATCG－3 "。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株的突變位點(diǎn)及測序分析

在目的基因靶位點(diǎn)上下游250 bp左右設(shè)計(jì)特異性檢測引物，以轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。對于測序分析，首先利用混池方法，將提取的轉(zhuǎn)基因植株的DNA每5株混成1個(gè)樣品，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送至生物公司測序。根據(jù)測序結(jié)果，再將產(chǎn)生編輯的混池樣品進(jìn)行單株測序，利用在線軟件DSDecode（http://dsdecode．scgene．com/）對突變位點(diǎn)進(jìn)行解碼，分析每株轉(zhuǎn)基因植株的突變情況。所用引物序列為MA1F：5 "－TGCGGGCTAATCCAACGGTT －3 "，MA1R：5 "－CGATTA CCAGCAGGCAACAG －3 "；MA2F：5 "－CTCTGATGCGTT TGCCCATT－3 "，MA2R：5 "－TTGTCCCTTGCCACACCAG T－3 "。

1.6 基因的表達(dá)分析

對于目的基因的組織特異性表達(dá)分析，田間收集野生型不同組織器官，包括莖頂端分生組織、葉、根、莖和不同時(shí)期幼穗，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用RT－PCR分析目的基因在不同組織器官中的特異性表達(dá)。對于編輯突變體的表達(dá)分析，提取T1代田間生長60 d的編輯突變體的葉片總RNA，利用M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用目的基因OsDUF393基因特異性引物進(jìn)行RT－PCR表達(dá)分析，引物序列為TestF：5 "－ACTCTCCACAAGACAATCAG－3 "；TestR：5 "－ATCATCTTTGCATTCGGCTG－3 "。

圖1 OsDUF393基因的結(jié)構(gòu)及編輯位點(diǎn)設(shè)計(jì)

圖2 OsDUF393基因CRISPR/Cas9編輯載體構(gòu)建

圖3 OsDUF393基因CRISPR-Cas9轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測

2 結(jié)果與分析

2.1 OsDUF393序列分析及靶位點(diǎn)的選擇

為了探索水稻基因OsDUF393的功能，用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向編輯該基因的CDS序列。通過水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫（http://rice．plantbiology．msu．edu/）查詢到OsDUF393基因的全長編碼序列，含有8個(gè)外顯子、7個(gè)內(nèi)含子，編碼1個(gè)209個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)（圖1）。對基因結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因隸屬于DUF393家族。進(jìn)一步分析OsDUF393基因序列發(fā)現(xiàn)，第3～8個(gè)外顯子的序列較短且找不到合適的靶位點(diǎn)。利用在線軟件E－CRISPR[23]在第1個(gè)及第2個(gè)外顯子發(fā)現(xiàn)了效率高、特異性好的sgRNA靶位點(diǎn)。據(jù)此設(shè)計(jì)了2個(gè)靶向編輯位點(diǎn)，分別命名為 target 1（TG1）和 target 2（TG2）。

2.2 OsDUF393基因CRISPR/Cas9編輯載體的構(gòu)建

根據(jù)上述靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)，將經(jīng)退火的引物連接至O－sU6－SK載體上，獲得有OsDUF393特異識別的sgRNA融合載體，分別為 OsU6－SK－TG1 和 OsU6－SK－TG2。將載體熱激轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定，凝膠電泳結(jié)果證實(shí)擴(kuò)增出的片段大小為400bp左右，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2－A），表明目的靶點(diǎn)已成功連入了OsU6－SK空載體。同時(shí)對連接成功的融合載體進(jìn)行測序確認(rèn)，結(jié)果表明，OsDUF393基因的靶序列已成功連接到了OsU6SK載體上。將構(gòu)建好的融合載體OsU6－SK－TG1、OsU6－SK－TG2，含有 Cas9 的 35SCas9－SK載體及pCAMBIA1300雙元載體，分別酶切回收，將回收產(chǎn)物進(jìn)行三片段連接（圖2－B），從而將帶有特異靶點(diǎn)的sgRNA及Cas9表達(dá)盒共同構(gòu)建到用于植物轉(zhuǎn)化的雙元載體pCAMBIA1300中。將連接成功的重組載體進(jìn)行質(zhì)粒酶切鑒定，結(jié)果表明，重組載體切出了預(yù)期的目的片段，片段大小正確（圖2－C），表明2個(gè)目的片段已成功連入了pCAMBIA1300空載體中。

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的獲得和分子檢測

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將2個(gè)靶點(diǎn)（TG1和TG2）的雙元載體分別導(dǎo)入野生型中花11中，最終獲得3個(gè)line的TG1轉(zhuǎn)基因植株30株，8個(gè)line的TG2轉(zhuǎn)基因植株70株。經(jīng)潮霉素抗性基因鑒定，100株轉(zhuǎn)基因植株均為轉(zhuǎn)基因陽性植株（圖3）。

2.4 編輯突變體的突變位點(diǎn)分析

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因植株中的目的基因OsDUF393是否被編輯，我們首先采用混池方法（BSA,bulked segregant analysis）進(jìn)行檢測，從轉(zhuǎn)基因植株中提取基因組DNA，每5株DNA作為1個(gè)混池進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行測序分析。獲得的30株TG1轉(zhuǎn)基因植株共分為6組進(jìn)行測序，編號為TG1－1～TG1－6；70株TG2轉(zhuǎn)基因植株共分為14組進(jìn)行測序，編號為 TG2－1～TG2－14。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TG1－3 和TG2－8出現(xiàn)套峰（圖4）。測序結(jié)果峰圖顯示，套峰出現(xiàn)在PAM序列（該序列為NGG，N為任意堿基）附近，說明這2組混池中目的基因OsDUF393可能被編輯。

圖4 轉(zhuǎn)基因植株混池測序分析

圖5 編輯突變體的測序分析及PCR驗(yàn)證

圖6 OsDUF393基因的組織特異性表達(dá)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證突變位點(diǎn)，將TG1－3和TG2－8兩組樣品，即10個(gè)單株的PCR產(chǎn)物，單獨(dú)測序。結(jié)果顯示，TG1－3 中有 3 株發(fā)生突變，突變體編號為 1#、2#、3#。TG2－8中有1株發(fā)生突變，突變體編號為4#。對這4個(gè)突變體進(jìn)行測序解碼分析，發(fā)現(xiàn)1#編輯突變體是1個(gè)單堿基插入的雜合突變體，在PAM序列－4區(qū)插入了1個(gè)A堿基（圖5A）。2#編輯突變體含有1個(gè)62 bp缺失的雜合突變體，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，可以擴(kuò)增出2條清晰的條帶（圖5B），對這2條帶進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)兩者之間有62 bp缺失（圖5B）。3#編輯突變體是1個(gè)純合缺失突變體，PCR檢測發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)物比野生型小了41bp（圖5C）。4#編輯突變體也是1個(gè)單堿基插入的雜合突變體，在PAM序列－2區(qū)插入了1個(gè)A堿基（圖5D）。

2.5 OsDUF393基因在水稻中的組織特異性表達(dá)分析

為了進(jìn)一步探究OsDUF393基因功能，利用RTPCR分析了目的基因在水稻不同器官中的表達(dá)情況。分別提取水稻莖頂端分生組織、葉、根、莖和不同時(shí)期幼穗的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果表明，OsDUF393主要在水稻葉片中表達(dá)，在其他組織器官中的表達(dá)非常微弱，很難檢測到（圖6），暗示了Os－DUF393是葉片特異表達(dá)的基因，可能在葉片的生長發(fā)育中具有重要的功能。

2.6 編輯突變體的表達(dá)分析

將上述1#～4#T0代編輯突變體（即轉(zhuǎn)基因當(dāng)代）獲得的種子進(jìn)行種植，分別獲得T1代1#～4#的轉(zhuǎn)基因株系，通過檢測均獲得了純合編輯突變體。為了檢測編輯突變體中OsDUF393的轉(zhuǎn)錄水平，提取1#～4#T1代轉(zhuǎn)基因株系中純合突變體單株的葉片RNA并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。通過RT－PCR分析突變體中OsDUF393基因的表達(dá)水平，結(jié)果表明，目的基因在不同純合編輯突變體中轉(zhuǎn)錄水平均有下降，2#純合編輯突變體中表達(dá)量明顯降低，在3#純合編輯突變體中幾乎不表達(dá)（圖7－A、圖7－B），表明編輯突變體中OsDUF393的轉(zhuǎn)錄受到影響。2#和3#純合編輯突變體均為較大片段缺失突變體，可能對DNA序列及結(jié)構(gòu)造成較大影響，目的基因OsDUF393轉(zhuǎn)錄水平受到影響較大。尤其3#突變體的41 bp堿基缺失是從目的基因的起始密碼子開始，可能對OsDUF393的起始轉(zhuǎn)錄造成了較大影響，致使3#株系純合編輯突變體不能檢測到該基因的表達(dá)。1#和4#純合編輯突變體為單堿基插入，可能對DNA序列及結(jié)構(gòu)造成影響較小，因此目的基因OsDUF393轉(zhuǎn)錄水平受到的影響較小。

圖7 純合編輯突變體的表達(dá)檢測

3 討論與結(jié)論

未知功能結(jié)構(gòu)域蛋白家族（DUFs）是一個(gè)有著眾多家族成員的蛋白家族，不同DUFs基因具有不同的生物學(xué)功能。DUF393家族屬于未知功能蛋白家族。一些研究初步表明，DUFs基因在逆境脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)，參與了水稻對生物或非生物脅迫的響應(yīng)。已報(bào)道Os－DUF500基因表達(dá)水平與水稻的白葉枯病抗性相關(guān)，利用RNAi技術(shù)敲降OsDUF500基因，在RNAi轉(zhuǎn)基因株系中發(fā)現(xiàn)水稻株高變矮、葉片變短，出現(xiàn)白色空秕谷，對白葉枯病菌的抗性增強(qiáng)[24]。DUF761家族基因OsLCL3受低溫強(qiáng)烈誘導(dǎo)，在低溫脅迫下，過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)胞膜表現(xiàn)出很強(qiáng)的穩(wěn)定性，且存活率明顯高于對照組，上調(diào)OsLCL3基因的表達(dá)水平能夠增強(qiáng)植株的耐低溫能力[25]。作為DUF蛋白家族中的一員，目前尚未有關(guān)于該家族基因生物學(xué)功能的報(bào)道。DUF393家族基因成員存在于許多植物中，如水稻、擬南芥、大豆、玉米及高粱等植物中均含有此家族成員基因。不同DUF393蛋白家族成員在蛋白序列上相似性較高，在其N端均存在2個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基。

本實(shí)驗(yàn)為了揭示OsDUF393基因在水稻生長發(fā)育中的功能，利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向編輯水稻基因OsDUF393，獲得了OsDUF393基因編輯突變體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2個(gè)靶點(diǎn)均獲得了不同類型的編輯突變體。而且編輯突變體的轉(zhuǎn)錄水平受到明顯的影響，說明CRISPR/Cas9載體正常工作，可以獲得預(yù)期突變體。擬南芥中與OsDUF393高度同源的基因—AT5G50100，編碼1個(gè)DCC1蛋白，能夠通過氧化還原調(diào)控ROS穩(wěn)態(tài)，從而調(diào)節(jié)擬南芥的芽再生過程。而活性氧又與大多數(shù)植物的抗逆應(yīng)答反應(yīng)息息相關(guān)。OsDUF393的組織特異性表達(dá)分析表明，該基因在葉片中特異性表達(dá)。我們推測OsDUF393基因可能與水稻的非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)，后續(xù)我們將對OsDUF393的不同T2代純合編輯突變體進(jìn)行高鹽、干旱、低溫等非生物脅迫處理，從而探究該基因的功能。并用GUS融合表達(dá)載體分析其啟動子活性及誘導(dǎo)表達(dá)；構(gòu)建OsDUF393基因的GFP融合載體，探究該基因的亞細(xì)胞定位，精確研究該基因功能。