代國紅 周寶龍 周佳 王艷龍 王光中 牛森 李成德 閆建洲

（1洋縣黑米名特作物研究所，陜西洋縣723300；2陜西省黑色有機(jī)食品工程技術(shù)研究中心，陜西洋縣723300；3陜西雙亞糧油工貿(mào)有限公司，陜西 漢中 723300；4陜西省水稻研究所，陜西漢中 723100；5洋縣農(nóng)業(yè)局，陜西 洋縣 723300；6洋縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，陜西 洋縣 723300；7洋縣科學(xué)技術(shù)局，陜西 洋縣723300；第一作者：1210255348＠qq．com；*通訊作者：953534306＠qq．com）

花色苷屬黃酮多酚類化合物，是植物花、葉、果實(shí)等器官呈現(xiàn)紅色和藍(lán)色的原因，它們經(jīng)常出現(xiàn)在植物中，尤其是漿果、蔬菜和葡萄中，是人類飲食的重要組成部分。許多研究表明，花青素具有廣泛的促進(jìn)健康的特性[1－5]。黑稻花色苷屬花色苷的一類，近幾年來，對黑稻花色苷提取、分析檢測及在食品工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用等研究較多。對于黑稻色素積累的部位也有人開始研究，一般認(rèn)為，有色稻穎果顏色是由于在種皮內(nèi)積累的色素造成的，穎果呈現(xiàn)烏黑、紅黑等色是穎果合成和積累花色素的緣故。普遍認(rèn)為黑米花色素只在穎果的果皮中合成和積累[6－12]，尚未見黑稻穎果生長期的積累變化規(guī)律及影響因素的有關(guān)報(bào)道。為此，筆者以洋黑3號為試驗(yàn)材料，研究了黑稻生育期內(nèi)不同海拔高度、溫度、積溫、播種期對農(nóng)藝性狀的影響和花色苷積累規(guī)律。同時(shí)，分析研究了氣候條件對黑稻生產(chǎn)過程中花色苷積累的影響，旨在探明黑稻穎果的發(fā)育環(huán)境條件和色素積累規(guī)律，為優(yōu)質(zhì)黑稻品種培育及高產(chǎn)栽培提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試黑稻品種為洋黑3號，由洋縣黑米名特作物研究所提供。表1為試劑清單，表2為儀器清單。

1.2 試驗(yàn)方法

1．2．1 花色苷吸收峰的確定

以矢車菊素－3－葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)品，用0．1mol/L鹽酸緩沖液配置濃度分別為 5．0、6．0、7．0、8．0μg/mL 矢車菊素－3－葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，以0．1 mol/L鹽酸緩沖溶液為空白對照，依次對上述標(biāo)準(zhǔn)溶液在200～700 nm下進(jìn)行全波段光譜掃描，掃描譜圖見圖1。由圖1可見，矢車菊素－3－葡萄糖苷的鹽酸緩沖液最大吸收波長為520 nm，由此設(shè)定花色苷測試波長為520 nm。

1．2．2 鹽酸濃度的影響

研究表明，黑米花色苷在酸性條件下能穩(wěn)定存在，保持其原有的色澤。實(shí)驗(yàn)選擇鹽酸為酸化試劑，配置鹽酸濃度為 0．1、0．5、1．0、1．5 和 2．0 mol/L 系列酸溶液。將該酸溶液分別與無水乙醇以15∶85比例混合作為稀釋液。取1 mL樣品分別加入9 mL不同鹽酸濃度的酸化乙醇溶液稀釋，測定吸光度，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，當(dāng)鹽酸溶液濃度為1．5 mol/L時(shí)顯色效果最好。

1．2．3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

表1 試劑清單

表2 儀器清單

圖1 掃描譜圖

圖2 鹽酸濃度對吸光度的影響

準(zhǔn)確稱取5．0 mg矢車菊素－3－葡萄糖苷對照品于50 mL容量瓶中，用上述稀釋液定容至刻度，得到濃度為100 mg/L矢車菊素－3－葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。分別準(zhǔn)確移取矢車菊素－3－葡萄糖苷儲備溶液 0、0．5、1．0、1．5、2．0 和 2．5 mL 于 10 mL 比色管中，稀釋液定容至刻度，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分光光度計(jì)波長設(shè)定為520 nm，以零點(diǎn)校正儀器，測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值。以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y=0．0354x+0．0123，R2=0．999，線性關(guān)系良好。

1．2．4 方法驗(yàn)證

1．2．4．1 方法精密度分析 黑米花色苷不穩(wěn)定，放置過程中容易氧化褪色，實(shí)驗(yàn)考察不同濃度矢車菊素－3－葡萄糖苷稀釋液的穩(wěn)定性。通過日內(nèi)（每隔1 h測定1次）和日間（每隔1 d測定1次）測定矢車菊素－3－葡萄糖苷稀釋液吸光度，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，測定矢車菊素－3－葡萄糖苷日內(nèi)精密度為 4．6%～7．9%，日間精密度為 5．7%～8．7%，說明矢車菊素－3－葡萄糖苷稀釋液較穩(wěn)定，方法的重現(xiàn)性較好（RSD＜10%）。

1．2．4．2 加標(biāo)回收率測定 通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，向已知濃度的黑米提取液樣中加入不同濃度梯度的矢車菊素－3－葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備得到加標(biāo)實(shí)驗(yàn)樣品。測定加標(biāo)樣品中花色苷含量，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，所建立的測定方法回收率范圍為91．3%～103．1%，準(zhǔn)確度較好。

1．2．5 黑稻穎果生長過程及花色苷積累的影響

圖3 矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）

圖4 洋黑3號穎果花色苷著色變化趨勢圖（B點(diǎn)）

在黑稻的抽穗期、乳熟期、蠟熟期采集黑稻植株樣品，于105℃殺青、80℃烘干至恒質(zhì)量后，從稻穗上脫粒穎果，稱取樣品45 g，研缽粉碎，過60目篩，加入57．2%酒精 200 mL、檸檬酸 1．0 g，65℃恒溫提取 1 h后，1500 r/min離心15 min，取上清液待測。

1．2．6 海拔高度對黑稻農(nóng)藝性狀及花色苷積累的影響

4月10－20日在洋縣樂康生態(tài)農(nóng)業(yè)公司院內(nèi)（A點(diǎn)，儻河河邊，海拔475 m）、洋縣龍亭鎮(zhèn)龍亭村（B點(diǎn)，海拔490 m）、黃安鎮(zhèn)劉家壩村（C點(diǎn)，海拔607 m）和八里關(guān)鎮(zhèn)八里關(guān)村（D點(diǎn)，海拔850 m）4個(gè)基地進(jìn)行播種，株距14 cm、行距30 cm。每667 m2施用三元復(fù)合肥30 kg，生長季節(jié)按黑稻常規(guī)管理方法進(jìn)行管理。調(diào)查統(tǒng)計(jì)不同海拔高度溫度和有效積溫對黑稻出苗時(shí)間、抽穗時(shí)間、收獲時(shí)間、生長期、產(chǎn)量及花色苷含量的影響。

1．2．7 播種時(shí)間對黑稻農(nóng)藝性狀及花色苷積累的影響

從4月10日開始至5月30日，在A基地同一海拔高度，每隔10 d播種3箱（泡沫箱規(guī)格56 cm×38 cm×21 cm，每箱保留 6～8株），每箱用土 40 kg，施用朱鹮牌有機(jī)肥 80 g、三元混合肥 10 g（N、P、K 比例為 15∶10∶20），硫磺調(diào)整土壤 pH 值（6．5～6．9）。調(diào)查統(tǒng)計(jì)同一海拔高度，播種時(shí)間對黑稻出苗時(shí)間、抽穗時(shí)間、收獲時(shí)間、生長期、產(chǎn)量及花色苷含量的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑稻穎果生長過程及花色苷積累

由圖4可以看出，黑稻栽培過程中，黑稻穎果發(fā)育抽穗期（1～7 d），大部分果皮呈綠色，其后隨著果皮中花色素的積累，乳熟期（1～14 d）、蠟熟期（7～9 d）穎果顏色由綠變紅。

水稻花色苷的蓄積是在乳熟期、蠟熟期，抽穗后的第2～4周是主要蓄積時(shí)間。黑稻穎果中花色素含量均在花后7 d開始迅速升高，花后14 d內(nèi)整個(gè)果皮細(xì)胞被花色素充滿，花后21～28 d最高。在穎果發(fā)育過程中，穎果花色素含量變化與穎果色澤變化相符，與柳敏等[13]的研究結(jié)果具有一致性。

2.2 海拔高度對黑稻農(nóng)藝性狀及花色苷積累的影響

由表5可以看出，在A、B、C、D 4個(gè)海拔點(diǎn)進(jìn)行播種，隨著海拔的上升，黑稻的生育期延長，單產(chǎn)降低，糙米花色苷含量增加。不同海拔種植結(jié)果表明，洋黑3號在海拔800 m以下的區(qū)域能夠正常生長發(fā)育，高海拔有利于花色苷的蓄積，但低海拔有利于產(chǎn)量的提升。

2.3 播種時(shí)間對黑稻農(nóng)藝性狀及花色苷積累的影響

在A點(diǎn)，4月10日至5月30日，間隔10 d播種的洋黑3號，樣品號按播種時(shí)間分為1～6號。從表6可見，4月10日播種的生長期最長為173 d，5月30日播種的生長期最短為143 d；4月20日播種的產(chǎn)量最高達(dá)480 kg/667 m2，5月10日播種的產(chǎn)量僅180 kg/667 m2，5月20日和5月30日播種的基本絕收。表明平川海拔500 m以下區(qū)域，黑稻的適宜播種時(shí)間為4月中旬至4月下旬，最遲不超過5月10日。由表6可以看出，隨著栽培時(shí)間的延后，黑糙米花色苷含量逐步遞增，后期低溫有利于花色苷的蓄積。可見，洋黑3號的適宜播種時(shí)間應(yīng)在4月10—20日，能夠較好協(xié)調(diào)產(chǎn)量與花色苷含量之間的關(guān)系。

2.4 氣象條件對黑稻農(nóng)藝性狀及花色苷含量的影響

穎果生長期平均溫度顯著影響穎果的著色。穎果生長期是出穗時(shí)間至收獲的時(shí)間，黑稻花色苷的蓄積是在乳熟期和蠟熟期，從發(fā)育抽穗后的第2～4周是主要蓄積時(shí)間。從表7可見，在海拔475 m處分期播種栽培的1～6號樣品，花色苷的蓄積期隨著溫度的提升而降低，1、2號樣品花色苷蓄積期的平均溫度23．6℃，花色苷含量低，4、5、6號樣品花色苷蓄積期的平均溫度22．5℃以下，花色苷含量高；在不同海拔播種的7～9號樣品，隨著海拔高度的提升，花色苷蓄積期的溫度也在降低，而花色苷含量在提升?？梢姡m當(dāng)?shù)蜏啬軌蛱岣呋ㄉ盏男罘e量，但低于21．0℃，明顯影響黑稻產(chǎn)量，黑稻穎果生長期平均溫度低于20．0℃將失去種植價(jià)值。

表5 不同海拔高度洋黑3號農(nóng)藝性狀及花色苷含量

表6 播種時(shí)間對洋黑3號農(nóng)藝性狀及花色苷積累的影響

表7 氣象條件對洋黑3號農(nóng)藝性狀及花色苷含量的影響

黑稻穎果生長期和有效積溫影響黑稻花色苷的蓄積。穎果生長期有效積溫500℃以下，明顯影響黑稻產(chǎn)量，有效積溫550℃以上，有利于產(chǎn)量提高，但有效積溫的降低能延長花色素在穎果中的沉積時(shí)間，增加穎果的著色程度。

3 討論與結(jié)論

影響黑稻生長發(fā)育的氣象條件主要有太陽輻射、溫度、降水、濕度、風(fēng)以及二氧化碳濃度等?；ㄉ卦诜f果果皮中的沉積具有時(shí)序性[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，黑稻花色苷的積累是在乳熟期、蠟熟期，抽穗后的第2～4周是主要積累時(shí)段。黑米色素的合成是生化反應(yīng)，受溫度影響最大?；ㄉ盏姆e累在其積累期有30 d左右，積累期的平均溫度在 21．0℃～23．0℃之間，花色苷含量高，但低于21．0℃，黑稻生長發(fā)育速度減慢，大幅減產(chǎn)，低于20．0℃將失去種植價(jià)值。

黑稻品種洋黑3號生長期約160 d左右，隨著氣溫的變化適當(dāng)延長或縮短。選擇合適的播種期，使稻株的穎果生長期處于光照強(qiáng)、平均氣溫在 21．0℃～23．0℃、晝夜溫差大的秋季，不僅能使有色稻植株的光合產(chǎn)物增加，有利籽粒的灌漿充實(shí)，而且能滿足有色稻穎果著色對光照和溫度的需求。洋黑3號適宜在海拔800 m以下區(qū)域生長，最佳在海拔700 m以下的區(qū)域。高海拔有利于花色苷的積累，但低海拔有利于產(chǎn)量的提升，溫度是其主要影響因素。平川500 m以下低海拔種植區(qū)，播種時(shí)間選擇在4月中旬；海拔500～600 m種植區(qū)，播種時(shí)間選擇在4月上旬后期；海拔600～700 m種植區(qū)，播種時(shí)間選擇在4月上旬前期。