馮浩 王永旺

摘要：本研究通過研究不同濃度次氯酸鈉溶液對(duì)培養(yǎng)基抑菌效果的影響，以污染率、褐化率以及存活率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，所用培養(yǎng)基的次氯酸鈉溶液濃度選擇為誘導(dǎo)、擴(kuò)繁最佳抑菌濃度選擇都是10mg/L。開放式組織培養(yǎng)技術(shù)可以不對(duì)組織培養(yǎng)效果造成影響，也不受到無菌操作的限制，可以有效降低樹木培育成本，減少樹木培養(yǎng)的環(huán)節(jié)，從根源上解決了當(dāng)前雜交構(gòu)樹的培育難題。

關(guān)鍵詞：雜交構(gòu)樹;組培;快繁;開放式

1 前言

雜交構(gòu)樹是當(dāng)前中科院科學(xué)專家利用雜交技術(shù)和高科技的生物技術(shù)培育出來的速生優(yōu)良樹種，其種植方式主要是插桿。但在實(shí)際應(yīng)用過程中，插桿種植具有較低的成活率，即便選擇最合適的種植時(shí)間和成活率較高的幼苗，成活率也不到四分之一?？茖W(xué)研究發(fā)現(xiàn)，無菌操作可以有效提升插桿幼苗的成活率，不受冷熱交替的限制。開放式組織培養(yǎng)在雜交構(gòu)樹培育中具有十分重要的意義，該技術(shù)可以不對(duì)組織培養(yǎng)效果造成影響，也不受到無菌操作的限制，可以有效降低樹木培育成本，減少樹木培養(yǎng)的環(huán)節(jié)。

2 實(shí)驗(yàn)材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用實(shí)驗(yàn)材料如表1所示。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 組培塑料杯前處理

組培塑料杯在使用前需要經(jīng)過滅菌處理，但基于開放式組織培養(yǎng)過程對(duì)無菌操作要求相對(duì)寬泛，本研究接種容器選取透光性好、便于運(yùn)輸?shù)乃芰媳媚滩璺馍w機(jī)對(duì)塑料杯進(jìn)行封口操作，在使用封口膜之前需要經(jīng)過同位素鈷60消毒處理。

2.2.2配制培養(yǎng)基

配制濃度分別為0mg/L（CK1，未滅菌）、0mg/L（CK2，經(jīng)121℃、20min滅菌）、5mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L的次氯酸鈉溶液作為培養(yǎng)基抑菌試劑。培養(yǎng)基的配制場(chǎng)地需要30min紫外線消毒處理，設(shè)置培養(yǎng)室溫度為25℃，每天日光燈照射12h，空氣相對(duì)濕度約70%，光照強(qiáng)度為2KLX-3KLX范圍內(nèi)。

2.2.3 接種方式

接種前24h需要對(duì)接種房間進(jìn)行紫外線消毒2h和酒精塵降處理。采用開放式接種法，CK2在超凈工作臺(tái)完成接種操作。接種操作在消毒處理的接種室內(nèi)進(jìn)行，具體方法為取經(jīng)過消毒的構(gòu)樹嫩芽放在接種盤上，剪去組織褐化部分，每個(gè)接種芽留一個(gè)生長(zhǎng)點(diǎn)。接種操作完成后灼燒瓶口，并迅速密封。

誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基每組10杯，接種2芽/杯，平行接種三次。擴(kuò)繁培養(yǎng)基每組20杯，接種6芽/杯，平行接種三次。完成接種操作后的一個(gè)月時(shí)間里，計(jì)算雜交構(gòu)樹引種的污染、褐化以及存活率。

2.2.4 污染率、褐化率以及存活率計(jì)算公式

污染率/褐化率/存活率（%）=污染瓶數(shù)/褐化瓶數(shù)/存活瓶數(shù)÷總接種瓶數(shù)X100%

3 結(jié)果與討論

3.1 誘導(dǎo)分化雜交構(gòu)樹次氯酸鈉最佳濃度

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，隨著次氯酸鈉溶液濃度的增加，污染率逐漸降低，當(dāng)次氯酸鈉溶液濃度高于30mg/L時(shí)，污染率已經(jīng)下降到10%以下，與其它組相比，污染率極低。隨著次氯酸鈉溶液濃度的增加，褐化率逐漸提高，當(dāng)次氯酸鈉溶液濃度高于30mg/L時(shí)，全部雜交構(gòu)樹的嫩芽全部死亡。究其原因可能是雜交構(gòu)樹是木本屬性，自身會(huì)大量分泌多酚類物質(zhì)，容易發(fā)生褐變反應(yīng)，此外，當(dāng)次氯酸鈉溶液濃度過高時(shí)，雜交構(gòu)樹的褐變程度也會(huì)加劇。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，次氯酸鈉溶液濃度為5mg/L、10mg/L時(shí)的褐變率分別為35%、40%，與CK2的褐變率極其接近。與此同時(shí)，隨著次氯酸鈉溶液濃度的增加，雜交構(gòu)樹的存活率逐漸下降，使用20mg/L-30mg/L濃度范圍內(nèi)的次氯酸鈉溶液，嫩芽存活率不到10%。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果看來，次氯酸鈉溶液濃度為30mg/L時(shí)，雜交構(gòu)樹污染率、存活率較褐化率較高;次氯酸鈉溶液濃度為5mg/L和10mg/L時(shí)，褐化率差別不明顯，但濃度為10mg/L的污染率和存活率有優(yōu)勢(shì)。因此，本研究選取雜交構(gòu)樹培養(yǎng)基中次氯酸鈉溶液濃度為10mg/L。存活的幼苗如圖1所示。

3.2 擴(kuò)繁雜交構(gòu)樹次氯酸鈉最佳濃度

結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，擴(kuò)繁雜交構(gòu)樹污染率隨著次氯酸鈉溶液濃度的增加而逐漸下降。當(dāng)次氯酸鈉溶液濃度為30mg/L時(shí)，污染率甚至低于CK2處理組。隨著次氯酸鈉溶液濃度的增加，擴(kuò)繁雜交構(gòu)樹的褐化率逐漸提高，對(duì)雜交構(gòu)樹嫩芽的生長(zhǎng)極為不利，甚至次氯酸鈉濃度時(shí)褐化率已經(jīng)高于80%。同時(shí)，隨著次氯酸鈉溶液濃度的增加，存活率逐漸下降，次氯酸鈉濃度為30mg/L時(shí)，存活率下降到6%。因此，擴(kuò)繁雜交構(gòu)樹次氯酸鈉最佳濃度選擇10mg/L。

4 結(jié)論

針對(duì)雜交構(gòu)樹培育技術(shù)來說，開放式組織培養(yǎng)的研究報(bào)道相對(duì)較少，但以往傳統(tǒng)的培養(yǎng)基因富營養(yǎng)化而為細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖提供了便利條件，不利于開放式組織培養(yǎng)技術(shù)的順利開展和進(jìn)行。如果可以采取有效措施來對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化處理，就可以在不影響雜交構(gòu)樹幼苗正常生長(zhǎng)和繁殖的前提下，降低培養(yǎng)基中蔗糖和其它有機(jī)物質(zhì)的使用量，有效節(jié)約培養(yǎng)成本，提高組織培養(yǎng)技術(shù)的成活率。本研究所用培養(yǎng)基的次氯酸鈉溶液濃度選擇為誘導(dǎo)、擴(kuò)繁最佳抑菌濃度選擇都是10mg/L。但基于現(xiàn)實(shí)應(yīng)用條件的限制，10mg/L的次氯酸鈉溶液濃度是否滿足生根培養(yǎng)、培養(yǎng)基優(yōu)化的需要還需要該領(lǐng)域科學(xué)技術(shù)人員的進(jìn)一步探索。

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（作者單位：1.保定市原種場(chǎng);2.易縣高村中易農(nóng)作物種植專業(yè)合作社）