陳愛鳳 丁士標(biāo) 林旭璦 孔亮亮 徐儉樸

肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是多種病因引起的以肺動脈壓和肺血管阻力進(jìn)行性增高為特征的綜合征。肺血管收縮、重構(gòu)和原位血栓形成是PAH形成和肺循環(huán)血流動力學(xué)改變的基礎(chǔ)，持續(xù)發(fā)展可導(dǎo)致右心衰竭和死亡[1]。PAH的病理改變主要包括內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和凋亡、中膜肥厚、炎癥細(xì)胞浸潤和肺小動脈血栓形成[1-2]。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能紊亂在PAH的發(fā)生和發(fā)展過程中起著關(guān)鍵性作用，表現(xiàn)為細(xì)胞一氧化氮合酶（nitric oxidesynthase，NOS）分泌減少，結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）、內(nèi)皮素-1和血栓素分泌增加[3-4]。目前的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療方法只能起到改善癥狀，提高生活質(zhì)量的目的，因此，亟需尋找更有效的治療方法。紅花是傳統(tǒng)的中草藥，其注射液由紅花提取精制而成，主要含有查耳酮類、漆樹黃酮、桑葉素、槲皮素、楊梅素等成分，具有抗氧化、抗凝、防止血栓形成、抗炎癥因子、抗氧自由基和擴(kuò)張血管、調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞增殖等作用[5]。本研究通過檢測紅花注射液對野百合堿（monocrotaline，MCT）誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞（human vascular endothelial cells，HUVECs）損傷模型中NO、內(nèi)皮型NO合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、CTGF等形成的影響，探討紅花注射液對PAH的治療作用。

1 材料和方法

1.1 材料 MCT購自美國Sigma公司（批號：C2401-1G）。將 MCT溶于 1.0mol/L 鹽酸，用1.0mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.2，并調(diào)整濃度為20mg/ml。紅花注射液購自山西華衛(wèi)藥業(yè)有限公司（國藥準(zhǔn)字Z14020008，批號：15010515）?？筫NOS多克隆抗體（批號：32027S）、抗β-actin單克隆抗體（批號：abs118937）、抗 CTGF 抗體（批號：86641S）購自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司?？侼O檢測試劑盒（批號：S0024）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：RR047A），TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ熒光定量PCR試劑盒（批號：RR820Q）購自大連寶生物科技有限公司。NO敏感性熒光材料二乙?！ざ被鶡晒馑兀―AF-2/DA）購自美國Sigma公司（批號：FCANOS）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 HUVECs購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫，采用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。其中MCT組、紅花注射液組在初始培養(yǎng)時加入終濃度為1μmol/L的MCT，培養(yǎng)至細(xì)胞平鋪培養(yǎng)板底80%～90%后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞增殖分析 將1×105個/ml的MCT處理過的HUVECs接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，邊緣孔用滅菌PBS填充，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h后，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，各孔加入終濃度分別為25、50、100、150、200μg/ml的紅花注射液，繼續(xù)培養(yǎng) 48h后，參照CCK-8試劑盒說明書測定細(xì)胞在OD570時的吸光值，計算細(xì)胞增殖情況，每孔均重復(fù)3次并設(shè)MCT組為對照。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-處理組OD值/對照組OD值）×100%。

1.2.3 細(xì)胞內(nèi)NO檢測 根據(jù)參照文獻(xiàn)[6] ，實(shí)驗(yàn)中設(shè)置未加入紅花及未加入MCT的細(xì)胞為空白對照組?？瞻讓φ战M，MCT組、紅花注射液組加入終濃度為1μmol/L的 NOS激動劑乙酰膽堿（ACh）和NO敏感性熒光材料二乙?！ざ被鶡晒馑兀―AF-2/DA），在室溫和37℃各孵育20min。激光共聚焦顯微鏡測定細(xì)胞在490nm和515nm的DAF-2熒光值，DAF-2熒光值的增加與NO濃度呈線性關(guān)系。

1.2.4 Western blot檢測 CTGF和eNOS收集培養(yǎng)的HUVECs細(xì)胞，用預(yù)冷1∶1的PBS緩沖液洗滌2次，加入100μl的細(xì)胞裂解液以裂解細(xì)胞，加熱變性后置于4℃保存。BCA法測蛋白濃度，各取50μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉膜2h，加入相應(yīng)的一抗和二抗，化學(xué)發(fā)光試劑增強(qiáng)反應(yīng)、X線片壓片、曝光。經(jīng)發(fā)光成像分析系統(tǒng)測光密度值。實(shí)驗(yàn)中以β-actin蛋白量作為對照。

1.2.5 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) 搜索Primer Bank，篩選HUVECs細(xì)胞適用的CTGF和eNOS熒光定量PCR引物（表1）。引物由上海Invitrogen公司合成。用酚/氯仿法提取以100μg/ml紅花注射液和（或）MCT處理的各細(xì)胞總RNA；以1μg的RNA為模版，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒合成 cDNA（37℃ 15min；85℃ 5s）；按照 TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（TliRNaseH Plus）試劑盒說明，以合成的cDNA為模板用480Ⅱ熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)條件為：變性95℃30s，1 個循環(huán)，PCR 反應(yīng)（95℃ 5s，60℃ 30s，40 個循環(huán)），熔解（95℃ 5s，60℃ 1 min，95℃，1個循環(huán)），降溫（40℃ 30s，1個循環(huán)）；實(shí)驗(yàn)中以β-actin作為對照。反應(yīng)完成后比對擴(kuò)增曲線和熔解曲線，用2-ΔΔCt法計算RQ值。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以表示；組間比較采用ANOVA分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同紅花注射液濃度對HUVECs增殖的影響見圖1。

圖1 紅花注射液抑制MCT誘導(dǎo)的HUVECs增殖

由圖1可見，隨著紅花注射液濃度的升高，對細(xì)胞增殖的抑制作用也越強(qiáng)（半數(shù)抑制濃度IC50為100μg/ml），紅花注射液對HUVECs細(xì)胞增殖的抑制作用呈濃度依賴性。

2.2 各組HUVECs NO生成的DAF-2熒光值比較見表2。

表2 各組HUVECs NO生成的DAF-2熒光值比較

由表2可見，空白對照組在ACh處理后DAF-2熒光值明顯增加，MCT組DAF-2的熒光值明顯低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而紅花注射液組的熒光值與空白對照組類似，亦增加明顯，顯著高于MCT組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。2.33組HUVECs eNOS和CTFG mRNA表達(dá)比較見圖2。

圖2 3組HUVECs eNOS和CTFG mRNA表達(dá)比較

由圖2可見，與空白對照組比較，MCT組HUVECs的eNOSmRNA表達(dá)水平降低，而CTFG mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與MCT組比較，紅花注射液組eNOSmRNA表達(dá)水平升高，CTFGmRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.4 各組HUVECs eNOS和CTGF蛋白表達(dá)比較見圖3。

圖3 各組HUVECs eNOS和CTGF蛋白表達(dá)比較

由圖3可見，MCT組HUVECs eNOS蛋白表達(dá)水平下調(diào)，CTGF蛋白表達(dá)水平上調(diào)，而紅花注射液組eNOS蛋白表達(dá)水平上調(diào)，CTGF蛋白表達(dá)水平下調(diào)。

3 討論

PAH是極難治愈的低存活率疾病[7]，目前在PAH的研究中，多采用MCT處理的方法獲得病理模型[8]。MCT可以與血管內(nèi)皮細(xì)胞NDA形成交聯(lián)，抑制細(xì)胞增殖，導(dǎo)致炎性介質(zhì)如內(nèi)皮細(xì)胞乳酸脫氫酶和前列腺素等的釋放增加，血管滲出、水腫及形成血栓，從而導(dǎo)致PAH[9]。

紅花是我們國家的傳統(tǒng)中藥，具有活血化瘀消炎及防止血栓形成、擴(kuò)張血管、調(diào)節(jié)心律等作用[10-12]，闡明紅花調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及抗炎作用的分子生物學(xué)機(jī)制，可為指導(dǎo)臨床用藥提供理論依據(jù)。PAH是慢性阻塞性肺部疾病發(fā)展為心臟病的重要環(huán)節(jié)，雖然發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但目前已有研究表明內(nèi)皮細(xì)胞損傷是PAH的起始環(huán)節(jié)，內(nèi)皮功能損傷引起肺血管過度收縮、肺動脈平滑肌細(xì)胞過度的分裂增殖，進(jìn)一步導(dǎo)致血管收縮和血管舒張的生理平衡改變[4-5]?？梢?，保護(hù)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞功能可有利于治療PAH。有研究提示肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞是肌化的可能來源細(xì)胞，因此適當(dāng)抑制其在PAH患者中內(nèi)皮細(xì)胞的增殖水平，對其肺血管重構(gòu)有積極意義。本研究進(jìn)行了紅花注射液抑制人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示隨著紅花注射液濃度的升高，對細(xì)胞增殖的抑制作用也越強(qiáng)（IC50為 100μg/ml），并且呈濃度依賴效應(yīng)，但紅花注射液濃度過高造成貼壁細(xì)胞的大量脫落。上述試驗(yàn)結(jié)果表明紅花注射液可抑制人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。

NO是重要的血管舒張因子，對血壓的調(diào)節(jié)具有重要作用[13]。MCT可抑制細(xì)胞中NO的產(chǎn)生，從而使肺動脈收縮，加速PAH的形成。本試驗(yàn)中，以MCT處理HUVECs，證明MCT可抑制NOS激動劑ACh導(dǎo)致的NO生成，而紅花注射液可以將該抑制作用降低，從而使NO的生成基本達(dá)到正常細(xì)胞水平。Western blot結(jié)果顯示，紅花注射液可減少野百合堿誘導(dǎo)的HUVECs中NOS蛋白表達(dá)降低程度，即紅花注射液可改善MCT對NOS基因轉(zhuǎn)錄及翻譯過程的抑制，并提高NOS mRNA的穩(wěn)定性，使NO合成增加，進(jìn)而通過NO的增加抑制了細(xì)胞的有絲分裂和細(xì)胞增生。

有研究表明，在MCT誘導(dǎo)的大鼠PAH模型中，CTGF是組織纖維化過程中的重要分子，CTGF在肺組織中mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高[14]，而高水平的CTGF導(dǎo)致Ⅰ型膠原蛋白及纖維連接蛋白的大量沉積，最終導(dǎo)致動脈平滑肌細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的重排[15]。本試驗(yàn)亦證明MCT可誘導(dǎo)HUVECs表達(dá)大量的CTGF，而在紅花注射液的作用下，CTGF的高表達(dá)可被抑制。但具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步,深入研究。筆者認(rèn)為紅花注射液可能通過改善動脈內(nèi)膜的結(jié)構(gòu)重構(gòu)，減少炎癥的發(fā)生，擴(kuò)張動脈，從而改善PAH患者的預(yù)后并降低病死率。