程如越 何 方 石 磊 李 鳴

(1. 四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院，成都 610041)(2. 四川大學(xué)華西醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，成都 610041)

新生動(dòng)物的人工喂養(yǎng)是研究生命早期營養(yǎng)調(diào)控、生長發(fā)育的重要前提[1]。大,小鼠是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中常用的重要的品種，成功的大小鼠人工喂養(yǎng)模型是營養(yǎng)、代謝、免疫等研究領(lǐng)域的重要基礎(chǔ)。在Reyniers等首次建立了無菌大鼠后[1]，Gustafsson、Pleasants等也建立了無菌大鼠[2-3]。Messer等在1969年首次采用在大鼠胃中安置胃管的方法進(jìn)行人工喂養(yǎng)[4]，而Hall在1975年改進(jìn)了這一方法，并成功建立了大鼠人工喂養(yǎng)的模型[5]。

相比之下，關(guān)于小鼠的人工喂養(yǎng)則起步較晚。近年來學(xué)者開始研究小鼠的人工喂養(yǎng)。West、Beierie等采用自制的喂養(yǎng)乳頭實(shí)現(xiàn)了哺乳期內(nèi)小鼠的人工喂養(yǎng)[6-7]。Zeng等參考Hall的大鼠胃造瘺的方法在新生小鼠胃中安置胃管，并喂養(yǎng)至14日齡[8]。盡管已有學(xué)者報(bào)道了哺乳期小鼠的人工喂養(yǎng)方法以及人工乳的配制，但由于新生小鼠的食管細(xì)小脆弱，哺乳工具難以制得，人工乳配方不適合等使得哺乳期小鼠的人工喂養(yǎng)方法仍需改進(jìn)。為此，本研究的目的是通過總結(jié)前人的經(jīng)驗(yàn)并進(jìn)一步探索哺乳期小鼠人工喂養(yǎng)的方法，以期為后續(xù)的研究提供方法與思路。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng):5只SPF級(jí)近交系BALB/c孕鼠，孕齡10～12 d，購自四川省成都市達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)：SCKY(川)2015-030]。BALB/c孕鼠均飼養(yǎng)于四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(川)2013-011]IVC塑料籠中待產(chǎn)，由于孕鼠的營養(yǎng)需要較普通鼠高，故給予繁殖飼料[9]，自由攝食與飲水。環(huán)境溫度：(24±1)℃，濕度：(55±10)%。

BALB/c孕鼠自然分娩所得新生小鼠，待其3日齡時(shí)，隨機(jī)分為母乳喂養(yǎng)組(maternal rearing,MR)和人工喂養(yǎng)組(artificial rearing,AR)。MR組小鼠由母鼠帶仔，飼養(yǎng)環(huán)境同母鼠。AR組小鼠由人工飼養(yǎng)，給予人工乳，環(huán)境溫度：(32±1)℃，隨日齡增加每天降低1 ℃，直至26～28 ℃；濕度：70%～80%，隨著日齡增加逐漸降低至50%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1人工乳的配制:人工乳的配制參考了BALB/c鼠乳，Smart等、Yajima等采用的人工乳配方[10-11]，由市售嬰兒配方奶粉、乳清蛋白粉和中鏈甘油三酯(medium chain triglyceride,MCT)粉配制而成(見表1)。

表1 小鼠人工乳組成及營養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets

1.2.2人工乳頭的制作: 人工乳頭以市售魚肝油膠囊的外殼為原材料改造而成。該外殼遇水即變軟，可保護(hù)小鼠口腔。制作方法：首先將外殼尖端剪開一小口，擠出魚肝油；然后將1 mL注射器的針筒與灌胃針相接，吸取30～40 ℃保溫的人工乳，灌入膠囊外殼。這樣便制成了一個(gè)簡易的人工乳頭。經(jīng)試驗(yàn)，一個(gè)外殼可裝0.3 mL的人工乳。

1.2.3喂養(yǎng)方案:5只孕鼠共分娩27只小鼠，將3日齡的所有小鼠隨機(jī)分為MR組13只和AR組14只(見表2)。MR組由各自的母鼠哺乳，不做其他干預(yù)。AR組采用自制的人工乳和人工乳頭哺乳，一天4次，分別于09:00，12:00，14:00，16:00時(shí)喂養(yǎng)。每天一只小鼠總的哺乳量為體質(zhì)量的20%，根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。哺乳過程是先擠一滴乳汁滴在小鼠嘴唇上，誘導(dǎo)其張口，后將外殼尖端送入小鼠口中，隨吞咽動(dòng)作輕輕擠壓乳頭底部，使小鼠吸吮乳汁并吞咽入胃。從3日齡開始每日稱體質(zhì)量并記錄至10日齡，在14日齡時(shí)終止研究，在觀察小鼠精神狀態(tài)、體質(zhì)量、生長發(fā)育、活動(dòng)能力、排便、毛色等情況后，解剖受試小鼠，觀察小鼠臟器的發(fā)育情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0分析。兩組間比較采用Student’s-t檢驗(yàn)；多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 實(shí)驗(yàn)分組Table 2 Pups grouped into AR and MR

注：小鼠編號(hào)指在喂養(yǎng)時(shí)的編號(hào)(1-1表示孕鼠1號(hào)分娩的1號(hào)小鼠)

Note：The lactating mice No. refers to the No. at the time of rearing (1-1 indicates the pup No.1 delivered to the mother No.1).

2 結(jié)果

2.1 AR組小鼠的生存率

本實(shí)驗(yàn)采用自制的喂養(yǎng)乳頭和小鼠人工乳實(shí)現(xiàn)了哺乳期BALB/c小鼠的人工喂養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)共喂養(yǎng)14只3日齡小鼠，5只小鼠成功喂養(yǎng)至14日齡。AR組小鼠從3日齡到10日齡，生存率達(dá)100%，11日齡生存率為92.9%，12日齡為78.6%，13日齡為50%，14日齡為35.7%。3～14日齡哺乳期內(nèi)MR組小鼠全部存活。

圖1 3～14日齡內(nèi)AR組小鼠的生存率曲線Fig.1 Survival rate curves of 3 to 14 days of AR mice

2.2 喂養(yǎng)期間內(nèi)兩組小鼠體質(zhì)量及其他指標(biāo)的變化

AR組和MR組小鼠在開始人工喂養(yǎng)時(shí)體質(zhì)量無明顯差異(3.89±0.87 vs 3.26±0.32，AR vs MR；P>0.05)。4日齡時(shí)，AR組體質(zhì)量低于MR組(3.74±0.83 vs 4.39±0.42，AR vs MR；P<0.05)。到10日齡時(shí)，AR組體質(zhì)量仍低于MR組(3.02±0.67 vs 9.00±0.70，AR vs MR；P<0.01)。AR組喂養(yǎng)期間內(nèi)體質(zhì)量未增長，呈緩慢下降趨勢，而MR組喂養(yǎng)期間內(nèi)體質(zhì)量持續(xù)增長。

圖2 MR組和AR組小鼠3～10日齡內(nèi)的生長曲線注：*P<0.05；**P<0.01Fig.2 The growth curves of the mice in the MR and AR groups during 3 to 10 daysNote：*P<0.05；**P<0.01

除體質(zhì)量外，AR組和MR組在長須、立耳、長牙、被毛、睜眼的日齡基本一致，但AR組睜眼的小鼠只有2～3只，MR組全部睜眼(見表3)。另外，AR組小鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)能力與MR組相比均較差；糞便較黏稠(見圖3)，但無腹瀉、便秘等胃腸道不適癥狀；解剖死亡小鼠發(fā)現(xiàn)胃腸道有明顯脹氣，并充滿整個(gè)腹部(見圖4)；但毛色均為白色，系正常發(fā)育。

表3 MR組和AR組小鼠生長發(fā)育等情況(天)Table 3 Growth and development of AR and MR mice(d)

圖3 AR組小鼠糞便情況Fig.3 Fecal condition of mice in AR group

圖4 AR組小鼠胃腸道脹氣Fig.4 Gastrointestinal flatulence of mice in AR group

3 討論

正常生長發(fā)育的小鼠，21日齡左右斷乳。睜眼后，即13～14日齡，可開始進(jìn)食固體飼料，后哺乳量逐漸下降，直至完全斷乳。哺乳期小鼠生長發(fā)育迅速，對(duì)營養(yǎng)要求較高，營養(yǎng)不良會(huì)影響體格、智能發(fā)育以及導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)的目的是探索14日齡小鼠的人工喂養(yǎng)方法。本次實(shí)驗(yàn)通過采用自制的人工乳和人工乳頭喂養(yǎng)14只自然分娩后3日齡的新生小鼠，到14日齡時(shí)存活5只，存活率為35.7%，在一定程度上實(shí)現(xiàn)了哺乳期小鼠的人工喂養(yǎng)，為今后的研究打下了良好的基礎(chǔ)并取得了珍貴的經(jīng)驗(yàn)。

本次實(shí)驗(yàn)主要觀察了哺乳期小鼠的生存率和體質(zhì)量。生存率是評(píng)價(jià)小鼠在哺乳期內(nèi)生存狀況的重要指標(biāo)，而體質(zhì)量是衡量生長發(fā)育和營養(yǎng)狀況的主要指標(biāo)。本次實(shí)驗(yàn)中，小鼠從10日齡后生存率逐漸下降，到14日齡時(shí)為35.7%，與多數(shù)報(bào)道差距較大。最終存活至14日齡的5只小鼠中，3日齡時(shí)體質(zhì)量均大于4 g；而在14日齡前死亡的9只小鼠中，其中8只3日齡時(shí)的體質(zhì)量小于4 g。由此我們推測開始AR時(shí)的小鼠體質(zhì)量可能影響AR組小鼠在喂養(yǎng)期間的生存率。Hoshiba也提到出生體質(zhì)量越大的小鼠越易喂養(yǎng)[12]。而4～10日齡內(nèi)AR組小鼠體質(zhì)量不增反減，低于MR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。體質(zhì)量的降低是生存率下降的重要因素。

我們推測本次實(shí)驗(yàn)中AR組小鼠人工乳營養(yǎng)組分不合理及哺乳量不足可能是導(dǎo)致其體質(zhì)量降低，生存率下降的主要原因。本實(shí)驗(yàn)的人工乳是根據(jù)Yajima等的小鼠人工乳配方改進(jìn)而來。Hussein等采用Yajima的配方實(shí)現(xiàn)了小鼠的人工喂養(yǎng)[13]。同時(shí)該配方能量及三大營養(yǎng)素的含量及供能比與BALB/c鼠乳接近。本次實(shí)驗(yàn)AR組小鼠在喂養(yǎng)期間內(nèi)未出現(xiàn)腹瀉、便秘、惡心、嘔吐等胃腸道不適癥狀，但有明顯的胃腸道脹氣。涂新明等提到人工乳中的酪蛋白是必需的，可使人工乳到胃中并凝固，如果不含酪蛋白，人工乳到胃中后，很快排到腸道, 充滿腸管，導(dǎo)致消化不良[14]。Yajima等也提出人工乳中酪蛋白和乳清蛋白的比例與大鼠腸道發(fā)育有關(guān)，堅(jiān)硬的酪蛋白乳凝塊可能是腸道黏膜肥大的重要因素[15]。Kanno等提到如果小鼠奶中的酪蛋白和乳清蛋白比例為6∶4時(shí)，其胃內(nèi)乳凝塊比較柔軟，形態(tài)和質(zhì)地與母乳類似[16]。此次實(shí)驗(yàn)中自制的人工乳不含酪蛋白，推測這可能與小鼠胃腸道脹氣有關(guān)。關(guān)于哺乳量的不足，主要由喂養(yǎng)方法與喂養(yǎng)頻率所決定。喂養(yǎng)方法包括強(qiáng)飼法和吸吮法，兩種方法均能成功哺育小鼠。本次實(shí)驗(yàn)采用的是吸吮法，即靠小鼠自己吸吮，而非強(qiáng)飼法。許多學(xué)者認(rèn)為吸吮法給小鼠喂的人工乳太少而不提倡該法。涂新明等、易萍還提出吸吮法耗時(shí)長，小鼠可因吸入空氣造成胃腸道脹氣和嗆咳，而采用了灌胃強(qiáng)飼法[14，17]。王建國、仉慧敏則認(rèn)為灌胃強(qiáng)飼法容易損傷小鼠食道上皮，甚至插破胃管致死，所以需要較高的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)。而吮吸是小鼠的本能反應(yīng)，剛出生就會(huì)吮吸，只要耐心細(xì)致地調(diào)節(jié)人工乳的黏稠度、流速、飼喂姿勢、小鼠的自身狀態(tài)等便可達(dá)到每日的哺乳量[18-19]。Hoshiba采用自制的人工乳頭和吸吮法，使1日齡的ICR小鼠成功喂養(yǎng)至14日齡，生存率達(dá)86.7%。Yasuda等也采用經(jīng)Hoshiba自制的人工乳頭改造而來的喂養(yǎng)裝置進(jìn)行人工喂養(yǎng)，使3日齡的小鼠全部存活至14日齡[20]。本次實(shí)驗(yàn)中由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，未能在夜間哺乳。兩次喂養(yǎng)的時(shí)間間隔較短，往往是上一次喂養(yǎng)的人工乳還沒消化完就要進(jìn)行下一次的哺乳。小鼠沒有足夠的時(shí)間對(duì)人工乳進(jìn)行消化，易導(dǎo)致腹脹及喂養(yǎng)量的下降，這樣便形成了惡性循環(huán)，難以達(dá)到小鼠每日的計(jì)劃哺乳量，導(dǎo)致體質(zhì)量下降，生長發(fā)育遲緩，生存率降低。

本實(shí)驗(yàn)采用自制的喂養(yǎng)乳頭和小鼠人工乳實(shí)現(xiàn)了哺乳期BALB/c小鼠的人工喂養(yǎng)，35.7%的人工喂養(yǎng)小鼠成功地存活至目標(biāo)的14日齡。但哺乳期內(nèi)AR組小鼠體質(zhì)量低于MR組，其主要原因可能是人工乳營養(yǎng)水平不合理及哺乳量不足。故如何提高哺乳期內(nèi)人工喂養(yǎng)小鼠的生存率及增加體質(zhì)量還需進(jìn)一步探索。