吳定宇 呂瑞青 彭 芳

(1. 大理大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，大理 671003)(2. 成都大熊貓繁育研究基地，成都 610081) (3.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，大理 671003)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是生命科學(xué)研究的基礎(chǔ)和條件。其質(zhì)量直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制的核心是對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攜帶的微生物和寄生蟲進(jìn)行嚴(yán)格控制。

大鼠細(xì)小病毒(Rat Parvovirus，RPV)屬于細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬，單鏈負(fù)鏈DNA病毒，無囊膜，具有多種血清型。該病毒存在于實(shí)驗(yàn)大鼠、野生大鼠和自然環(huán)境中，嚴(yán)重危害實(shí)驗(yàn)大鼠健康，感染后可造成動(dòng)物死亡和種群繁殖率下降，造成環(huán)境污染。大鼠排泄物和分泌物是主要的傳染源。該病毒同時(shí)會(huì)污染血清、細(xì)胞培養(yǎng)物、胚胎等生物樣品，尤其是該病毒某些毒株可以污染腫瘤細(xì)胞系，對(duì)腫瘤細(xì)胞造成抑制。為控制該病毒傳播，確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量，已建立了RPV的多種檢測方法。本文就目前大鼠細(xì)小病毒檢測方法進(jìn)行綜述。

1 大鼠細(xì)小病毒毒株分類

RPV分為三個(gè)血清型包括RPV-1(Rat Parvovirus Type 1)，KRV(Kilham Rat Virus)和H-1(Toolan’s H-1)[1]。根據(jù)我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)檢測的規(guī)定[2]， SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)大鼠須檢測RPV的KRV株和H-1株。國外對(duì)RPV分類與檢測范圍和我國不同，美國查爾斯河實(shí)驗(yàn)室(Charles River Laboratories)[3]，指出RPV病毒包括RPV-1，RPV-2(Rat Parvovirus Type 2)，RMV(Rat Minute Virus)，KRV，H-1。歐洲實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)(FELASA)[4]要求檢測KRV，RMV，RPV和H-1。具體見表1。

表1 不同國家和地區(qū)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)大鼠RPV血清型的檢測Table 1 The Serological detection of RPV for SPF rat in different countries and regions

注：●代表檢測

Note：●show detection

1959年Kilham和Olivier[5]發(fā)現(xiàn)在大鼠腫瘤細(xì)胞系中存在一種污染性物質(zhì)，經(jīng)分離發(fā)現(xiàn)該污染物為病毒，并稱為Kilham rat virus(KRV)或Rat Virus(RV)。1960年Toolan等[6]總結(jié)前人研究，通過移植人類腫瘤的無細(xì)胞(Cell-free)游離成份，會(huì)導(dǎo)致倉鼠出現(xiàn)病變，認(rèn)為這種可濾過性因子是病毒引起的，并從大鼠中分離該因子，移植到人肝癌細(xì)胞1(HEp-1)中，最終鑒定為病毒，這種病毒稱之為Toolan病毒，通常稱之為H-1病毒。

1998年Ball-Goodrich等[7]發(fā)現(xiàn)了一種新的大鼠細(xì)小病毒PRV-1，通過克隆、DNA序列分析來與其他細(xì)小病毒進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，PRV-1的編碼衣殼蛋白的VP1序列和其他細(xì)小病毒的VP1序列相似度不超過69%，這就解釋了PRV-1的抗原差異性。同時(shí)，Ball-Goodrich進(jìn)行抗體檢測分析發(fā)現(xiàn)，其有別于KRV和H-1不同的血清型，是第三種血清型。2002年Wan等[8]發(fā)現(xiàn)了之前三種大鼠細(xì)小病毒不同的RMV毒株，分別是RMV-1a,RMV-1b,RMV-1c,通過基因組核苷酸序列分析和蛋白質(zhì)氨基酸序列預(yù)測的方法，發(fā)現(xiàn)三種RMV毒株它們有著共同的啟動(dòng)子和剪切區(qū)域，轉(zhuǎn)錄起始密碼子和終止密碼子，它們基因序列的同源性約97%，氨基酸序列的相似性約95%，RMV與KRV和H-1的基因序列差異性小，但是與PRV-1存在較大差異。通過HAI試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RMV有著與KRV、H-1和RPV-1不同的血清型。

2 大鼠細(xì)小病毒檢測方法

2.1 毒株分離與鑒定

對(duì)疑似感染細(xì)小病毒的大鼠進(jìn)行組織取材，取材部位根據(jù)可能感染毒株的不同而不同。將取材的組織進(jìn)行培養(yǎng)，獲取上清液，用濾膜過濾，濾過液接種特定細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后進(jìn)行病毒檢測，如動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)鑒定、血清學(xué)鑒定等。

國外一般采用NB-324 K細(xì)胞對(duì)H-1毒株進(jìn)行分離培養(yǎng)[9-11],如Leuchs等在研究如何高質(zhì)量大規(guī)模純化生產(chǎn)H-1毒株時(shí)，采用由SV40轉(zhuǎn)化的新生兒腎細(xì)胞NB-324 K，來提高H-1作為DNA病毒的復(fù)制擴(kuò)增能力。對(duì)KRV株一般采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠腎細(xì)胞(NRK細(xì)胞)[12-13]，KRV病毒在NRK細(xì)胞上會(huì)形成吞噬斑，所以可以通過病毒空斑實(shí)驗(yàn)檢測KRV毒株。

劉先菊等[14-15]分別建立了大鼠細(xì)小病毒KRV株和H-1株的細(xì)胞培養(yǎng)方法。采用大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(Rat glial cell line C6)培養(yǎng)大鼠細(xì)小病毒KRV和H-1，待細(xì)胞病變達(dá)到測定標(biāo)準(zhǔn)后，進(jìn)行FITC鑒定所培養(yǎng)病毒的抗原，用HA測定培養(yǎng)物上清效價(jià)，用DNA測序鑒定所培養(yǎng)病毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用C6細(xì)胞系可以大量培養(yǎng)KRV和H-1。

2.2 血清學(xué)檢測

血清學(xué)檢測是診斷和鑒定病毒的重要方法之一。我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了四種方法用于大鼠細(xì)小病毒的檢測[2]：血凝抑制試驗(yàn)(HI)、免疫酶試驗(yàn)(IEA)、免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。

吳小閑等[16]采用HI方法檢測大鼠細(xì)小病毒RV株(也稱KRV)和H-1株，均發(fā)現(xiàn)存在陽性感染的情況。賀爭鳴等[17]采用ELISA、IEA和HI這三種方法進(jìn)行比較，檢測了大鼠細(xì)小病毒RV株，發(fā)現(xiàn)ELISA和IEA在重復(fù)性和抗體陽性檢出率方面均優(yōu)于HI(P<0.05)。王翠娥等[18]采用ELISA方法對(duì)2012年至2013年國內(nèi)36家單位的大鼠和小鼠血清進(jìn)行病毒抗體檢測，檢測出來的陽性樣品再用免疫熒光試驗(yàn)(IFA)進(jìn)行復(fù)檢，大鼠細(xì)小病毒檢測項(xiàng)目按照查爾斯河實(shí)驗(yàn)室的檢測項(xiàng)目進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)大鼠細(xì)小病毒毒株RPV、H-1、KRV、RMV均呈陽性。李曉波等[19]報(bào)道，在16個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行比對(duì)中，14個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用ELISA，占87.5%，3個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用IFA方法，另有1個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)采用IFA和ELISA方法。目前，對(duì)大鼠細(xì)小病毒進(jìn)行檢測的進(jìn)口ELISA試劑盒一般采用Charles River、Biotech Trading Partners、XpressBio Life Science等公司產(chǎn)品。國產(chǎn)ELISA大鼠細(xì)小病毒檢測試劑盒主要采用中國食品藥品檢定研究院產(chǎn)品。付瑞等[20]建立了H-1細(xì)小病毒抗體ELISA檢測方法，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與大鼠KRV病毒有交叉反應(yīng)。

不同國家或地區(qū)檢測大鼠細(xì)小病毒毒株類型不同，初檢和復(fù)檢的方法也有所差異。如美國查爾斯河實(shí)驗(yàn)室的動(dòng)物診斷研究服務(wù)部[21]對(duì)近五年北美地區(qū)和西歐(主要是法國)的大鼠和小鼠流行病學(xué)情況進(jìn)行研究。共收集了50萬份小鼠樣品和8萬份大鼠樣品。采用血清學(xué)方法檢測大鼠細(xì)小病毒(病毒毒株為KRV、RMV、H-1和RPV)。初步檢測采用多重免疫熒光方法(Multiplexed Flurometric Immuneno Assay，MFIA)或ELISA，對(duì)于檢測出的陽性樣品復(fù)檢采用IFA或HAI，具體見表2。

表2 SPF級(jí)大鼠細(xì)小病毒血清學(xué)檢測(查爾斯河實(shí)驗(yàn)室)Table 2 The Serological detection of rat parvovirus for SPF rat in Charles River Laboratories

Manjunath等[22]對(duì)印度26個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)構(gòu)的大鼠和小鼠進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查，每個(gè)機(jī)構(gòu)分別采集5份大鼠和5份小鼠血樣，在130份大鼠血樣中用ELISA方法檢測大鼠細(xì)小病毒KRV株和RPV株，發(fā)現(xiàn)RPV感染率在5.38%，KRV無感染。Mcinnes等[23]在2004年到2009年間從澳大利亞、新西蘭和新加坡等國家的大學(xué)、研究中心、科研機(jī)構(gòu)獲取SPF級(jí)的大鼠和小鼠，采用過量CO2安樂死，在收集的血清和組織樣品中檢測出大鼠細(xì)小病毒，毒株包括H-1，KRV，RMV和RPV。檢測方法為首先進(jìn)行ELISA檢測，對(duì)于ELISA檢測結(jié)果不確定或可疑的，再用IFA進(jìn)行重測。Liang等[24]、 Zenner和Reqnault[25]以及Schoondermark等[26]對(duì)不同國家或地區(qū)大鼠和小鼠進(jìn)行病毒流行調(diào)查和血清學(xué)篩查，均采用ELISA作為大鼠和小鼠細(xì)小病毒的首選檢測方法。

綜上所述，國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室在檢測大鼠細(xì)小病毒毒株種類上存在差異，但普遍采用血清學(xué)檢測方法，ELISA使用最多。對(duì)于某些血清樣品結(jié)果的不確定性，通常采用IFA或HAI進(jìn)行復(fù)檢，以對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。

2.3 分子生物學(xué)檢測

采用普通PCR檢測大鼠細(xì)小病毒，如Besselsen等[27]采用PCR技術(shù)來檢測H-1和KRV毒株，通過設(shè)計(jì)引物來擴(kuò)增H-1和KRV編碼衣殼蛋白的VP基因?yàn)槟康钠?。Wan等[28]采用PCR檢測RPV和RMV病毒，設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增RPV的NS區(qū)序列和RMV的VP區(qū)序列目的基因。

除普通PCR方法之外，我國學(xué)者還采用多重PCR方法進(jìn)行大鼠細(xì)小病毒的分子生物學(xué)檢測。李曉波等[29]建立對(duì)大鼠H-1和KRV毒株檢測的雙重PCR方法，分別設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增目的片段是病毒的衣殼蛋白基因編碼區(qū)(VP)，并確定2對(duì)引物無交叉反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)能夠高效檢測大鼠細(xì)小病毒的感染。饒丹等[30]根據(jù)大鼠細(xì)小病毒基因特異性，采用雙重PCR的方法，來檢測H-1、KRV、RMV和RPV四種大鼠細(xì)小病毒，在VP2基因篩選一對(duì)用于特異擴(kuò)增RPV毒株的引物，在NS1基因設(shè)計(jì)一對(duì)用于擴(kuò)增H-1、KRV和RMV的引物，敏感實(shí)驗(yàn)表明，雙重PCR的最低檢測限可達(dá)1 000拷貝/μL。

以高通量測序方法為基礎(chǔ)，可以進(jìn)行不同毒株的大鼠細(xì)小病毒檢測。傳統(tǒng)的基因測序技術(shù)采用Sanger法，存在成本高、耗時(shí)及測序樣品受限等不利因素，Life Sciences公司發(fā)明了高通量測序技術(shù)又稱第二代測序技術(shù)(next generation sequencing,NGS)可以對(duì)上百萬DNA分子進(jìn)行測序檢測。查爾斯河實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)開展了商業(yè)化高通量試驗(yàn)—檢測DNA病毒服務(wù)。H?fler等[31]針對(duì)嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存在的病毒、細(xì)菌的監(jiān)控，開發(fā)出一種新的高通量多重PCR分析方法，稱之為rDVF(rodent DNA virus finder)，可以同時(shí)鑒定24種大鼠和小鼠DNA病毒感染情況，其中大鼠細(xì)小病毒包括H-1、RPV、KRV和RMV。

Luminex液相芯片分析技術(shù)可進(jìn)行多種微生物和病毒的檢測，其技術(shù)包括xMAP技術(shù)和xTAG技術(shù)。xTAG技術(shù)使用專有通用標(biāo)簽系統(tǒng)，易于進(jìn)行優(yōu)化和核酸檢測開發(fā)，Luminex公司所提供的基于xTAG技術(shù)的核酸檢測，包括感染性疾病和基因檢測相關(guān)的臨床診斷檢測。如對(duì)多種腸道病原體和呼吸道病毒均可以采用xTAG技術(shù)進(jìn)行檢測[32-33]。Xu等[34]發(fā)明一種陣列式xTAG檢測方法，可同時(shí)檢測大鼠細(xì)小病毒KRV、H-1、RPV和RMV，并對(duì)這四種毒株予以區(qū)別，通過xTAG技術(shù)和常規(guī)PCR技術(shù)檢查了50個(gè)臨床樣品，結(jié)果顯示高度一致。

3 結(jié)語

病毒分離培養(yǎng)和觀察鑒定被認(rèn)為是病原微生物檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”(Gold Standard)，但缺點(diǎn)是檢測周期長，速度慢，對(duì)操作要求較高且成本也高。

血清學(xué)檢測是現(xiàn)行的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法，目前各實(shí)驗(yàn)室普遍采用ELISA進(jìn)行大鼠細(xì)小病毒初篩，復(fù)檢時(shí)用IFA或HIA進(jìn)行。雖然ELISA和IFA檢測敏感性好，但是由于大鼠細(xì)小病毒毒株的非結(jié)構(gòu)蛋白相對(duì)保守，導(dǎo)致抗體會(huì)產(chǎn)生交叉反應(yīng)，因此ELISA和IFA檢測的特異性較差，不易將不同毒株的細(xì)小病毒區(qū)分開來。HIA檢測有一定特異性，但由于其只針對(duì)抗體直接作用于不同毒株的血細(xì)胞凝集素上，形成血凝抑制反應(yīng)，因此敏感性較低。

以PCR為主的分子生物學(xué)技術(shù)具有高效、快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，但該技術(shù)也存在有假陽性和假陰性的缺點(diǎn)。目前該技術(shù)及衍生技術(shù)廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒檢測中。多重PCR及液相芯片分析技術(shù)等方法可以快速區(qū)分不同毒株的大鼠細(xì)小病毒。

細(xì)小病毒是嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)大鼠健康的病毒之一，因此建立起靈敏、準(zhǔn)確、操作方便的檢測方法，是準(zhǔn)確檢測和有效控制該病毒傳播的重要手段。