席世兵 楊 敏 謝集建 景衛(wèi)利 李興朝 李 濤

(湖北省十堰市太和醫(yī)院兒童醫(yī)療中心兒科2病區(qū)，十堰 420000)

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

低體質(zhì)量兒配方奶粉(特別能恩)由雀巢公司提供；脂肪乳注射液(C14～C24)由華瑞制藥有限公司提供；湯臣倍健蛋白質(zhì)粉購自朗臣健益公司；LPS(E．coli 055：B5)購自美國Sigma公司；喂養(yǎng)管由一次性使用靜脈留置針(青島，威高)改裝；ZKY-4F智能控氧儀、XBS-01多功能小白鼠試驗(yàn)箱(杭州愛普儀器設(shè)備有限公司)；保育箱由HW-1000超級恒溫水浴箱改裝(成都泰盟科技有限公司，成都)；SM-3B手術(shù)顯微鏡(美國 AmScope公司)；尼康D5100照相機(jī)(日本，尼康)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級出生2 h內(nèi)未開奶新生SD大鼠90只，生產(chǎn)許可證:SYXK(E鄂)2011-0031,購自湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物中心。

1.3 方法與分組

1.3.1分組：將體質(zhì)量(5.6～8.5) g新生大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分組。分為5組，對照組10只，實(shí)驗(yàn)組每組20只。A組與代母鼠同籠鼠乳喂養(yǎng)，且未行任何干預(yù)；B 組人工喂養(yǎng)+缺氧冷刺激+LPS灌胃(5 mg/kg)；C組人工喂養(yǎng)+缺氧冷刺激+LPS灌胃(10 mg/kg)；D組人工喂養(yǎng)+缺氧冷刺激+LPS腹腔注射(2 mg/kg)；E組人工喂養(yǎng)+缺氧冷刺激+LPS腹腔注射(5 mg/kg)。

1.3.2鼠乳代乳品的配置及人工喂養(yǎng)：B、C、D、E組新生大鼠出生后即置于自制的保育箱內(nèi)(溫度 37 ℃；濕度 45%～55%)，采用代乳品人工喂養(yǎng)，代乳品參考Auestad[1]研究報(bào)道配制，每100 mL代乳品添加早產(chǎn)兒奶粉1.6 g，加朗蛋白粉8.7 g，脂肪乳48 mL，總熱量約581 kJ，最終成分及熱量如表1所示。喂養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)[2]并適當(dāng)改進(jìn)，采用1 mL注射器連接威高靜脈留置針作為喂養(yǎng)管，沿新生大鼠一側(cè)口角緩慢、輕柔插入約會(huì)厭水平(深度0.8～1.0 cm)，當(dāng)新生鼠出現(xiàn)張口、吞咽動(dòng)作時(shí)，緩慢注入代乳品每4 h給予代乳品約0．1 mL/次，每12 h增加0.05 mL，第2天增至0．3 mL/次，72 h后，停止缺氧冷刺激，繼續(xù)喂養(yǎng)12 h、取材。

表1 鼠乳成分及代乳品成分Table 1 Rat milk and simulated milk ingredients

1.3.3缺氧及冷刺激：實(shí)驗(yàn)組新生大鼠首次代乳品喂養(yǎng)后1 h，預(yù)設(shè)ZKY-4F智能控氧儀氧濃度為0%～0.5%，打開氮?dú)夤揲y門及流量表，控制氮?dú)饬髁吭? L/min左右，待箱內(nèi)氧濃度<0.5%，將新生大鼠置入缺氧箱內(nèi)，缺氧7 min，轉(zhuǎn)置于4 ℃冷藏室7 min，D、E組在冷刺激結(jié)束后分別接受2 mg/kg、5 mg/kg LPS(LPS均溶于0.1 mL生理鹽水)，注射結(jié)束后將所有新生鼠放回保育箱復(fù)溫，上述操作每隔12 h一次，連續(xù)3 d。

1.3.4標(biāo)本收集：正常對照組及實(shí)驗(yàn)處理組新生鼠在末次處理后12 h或自然死亡后，立即打開腹腔取近回盲部小腸3 cm，近回盲1 cm置于4%甲醛中固定，剩余 2 cm腸管置液氮中儲(chǔ)存?zhèn)溆米錾治觥?/p>

1.3.5組織病理學(xué)檢查：近回盲部小腸于4%甲醛溶液中固定24 h以上，脫水、石蠟包埋，取冠狀面、5 μm切片，HE染色后在光鏡下觀察各組織的形態(tài)學(xué)改變。參照文獻(xiàn)[3]的病理評分標(biāo)準(zhǔn)對回盲部進(jìn)行腸組織損傷評分：0分：腸黏膜絨毛完整，結(jié)構(gòu)正常；1分：絨毛輕度水腫，上皮脫落僅限于絨毛頂部；2分：絨毛中部損傷壞死；3分：絨毛缺失，隱窩仍可識別；4分：黏膜上皮結(jié)構(gòu)完全缺失，或透壁壞死。以取樣品中觀察到的最高分?jǐn)?shù)確定為腸道的損傷程度，組織學(xué)評分≥2分確認(rèn)為NEC。

1.3.6炎癥因子檢測： 根據(jù)試劑盒說明書操作方法，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各組新生鼠小腸組織中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

用SPSS 20．0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用單因素多組方差分析，多樣本等級資料采用kruskal-wallis秩和檢驗(yàn)結(jié)合Nemenyi法檢驗(yàn)做兩樣本間分析，各組鼠存活情況采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析；P

2 結(jié)果

2.1 一般狀況及生長狀況

A組活動(dòng)度良好，進(jìn)食及排便皆正常，無腹脹及腹瀉，體質(zhì)量增加良好；B、C、D、E組在缺氧過程中，均有呼吸困難，紫紺，抽搐及大小便失禁。B、C組造模后新生鼠均出現(xiàn)活動(dòng)減少，反應(yīng)稍遲鈍，體質(zhì)量減輕、腹脹腹瀉，排黃綠色黏液便甚至血便情況。其中，D組大鼠注射LPS后約60～120 min出現(xiàn)抖動(dòng)、精神萎靡，活動(dòng)減少，6～12 h后開始腹脹、腹瀉，活動(dòng)減少，體質(zhì)量減輕。E組在LPS注射后30 min左右出現(xiàn)煩躁、尖叫、黏膜蒼白、晦暗，進(jìn)而活動(dòng)減少、萎靡，活動(dòng)遲緩，4～6 h出現(xiàn)腹脹、黃綠稀便或黑便，3 h開始陸續(xù)出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)鼠自然死亡。

2.2 生存狀況及體質(zhì)量變化情況

根據(jù)各組實(shí)驗(yàn)鼠存活情況，通過生存分析顯示，實(shí)驗(yàn)組較對照組均存在差異(P<0.05),B、C、D組間生存差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PBC=0.68、PCD=0.44、PBD=0.24)，但D、E組間生存差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.04)，大劑量LPS(5 mg/kg)腹腔注射較小劑量LPS(2 mg/kg)腹腔注射可顯著增加實(shí)驗(yàn)鼠的死亡率(P<0.05)。A至E組NEC發(fā)病率分別為0/10、25%(5/20)、35%(7/20)、75%(15/20)、80%(16/20)，死亡率分別為：0/10、15%(3/20)、20%(4/20)、35%(7/20)、60%(12/20)。對死亡新生鼠解剖、取材、病理評分，若NEC病理評分≥2分，認(rèn)為是NEC相關(guān)性死亡，<2分認(rèn)為是其他非NEC相關(guān)性死亡， A、B組均無非NEC相關(guān)性死亡；C、D、E組分別有1、2、5只出現(xiàn)非NEC相關(guān)性死亡。除A組外，實(shí)驗(yàn)組新生鼠均有不同程度體質(zhì)量減輕，除B、C組間體質(zhì)量減輕無差異外， C、D、E組間體質(zhì)量減輕均有明顯差異(見圖1)。

2.3 腸組織病理改變

顯微鏡下可見正常大鼠腸道空腸呈乳白色、回結(jié)腸為淡黃色，紅潤有光澤；腸管輕度擴(kuò)張、充血；腸壁積氣變薄，呈紫黑色，輕度腹水；腸管大量積氣，發(fā)黑、壞死，穿孔、變脆、大量腹水(如圖2A～E)；根據(jù)HE染色結(jié)果進(jìn)行病理評分：圖2F至J分別代表0分、1分、2分、3分、4分。

2.4 病理評分結(jié)果

采用盲法由3名研究人員對NEC標(biāo)本進(jìn)行病理評分，評分不一致者，再由第4名研究人員介入討論確定病理評分。評分結(jié)果如圖1C，采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)提示5組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),進(jìn)一步采用Nenmenyi法檢驗(yàn)提示實(shí)驗(yàn)組間NEC病理評分均無顯著性差異(P>0.05)。

2.5 小腸組織內(nèi)炎癥因子變化

建模后測得各組實(shí)驗(yàn)鼠小腸組織中腫瘤壞死因子-α結(jié)果(如圖1.D)，結(jié)果顯示LPS經(jīng)胃腸道給藥組，不同劑量組間較對照組，TNF-α水平差異性顯著(P<0.05)；經(jīng)腹腔注射給藥組，大劑量組較小劑量組小腸組織內(nèi)TNF-α水平差異也較顯著(P<0.05)，提示高劑量組系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)更重。

圖1 生存狀況及體質(zhì)量病例損傷程度及小腸組織內(nèi)腫瘤壞死因子α濃度變化情況注：A：實(shí)驗(yàn)鼠生存分析大劑量LPS腹腔注射組生存率顯著降低(P<0.05)；B： 實(shí)驗(yàn)前后新生鼠體質(zhì)量變化，正常對照組體質(zhì)量增加 良好，但NEC模型組體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)；C：病理學(xué)評分及統(tǒng)計(jì)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組損傷程度較正常組顯著增高，但LPS口服組間無 顯著差異，LPS腹腔注射組間無顯著差異(P≥0.05)；D：小腸組織中TNF-α濃度 實(shí)驗(yàn)組較對照組顯著升高，LPS經(jīng)腹腔注射組 較口服組小腸組織中TNF-α水平顯著較高(P<0.05)，且TNF-α升高水平與LPS劑量呈正相關(guān)。Fig.1 The survival analysis (A), change of body weight (B), pathogenic score(C) TNF-α concentration in intestine(D)Note：A：The survival rate of Group E (large-dose LPS intraperitoneal injection) is decreased significantly (P<0.05)，but difference between Group B, Group C and Group D were not significant (Fig1A)；B：The change of body weight during study.The body weight obtain in Group A is normal, but the decrease of body weight in NEC model(Group B, C, D and E) was significant (P<0.05)； C：The pathological scores of intestinal injury is increased significant in experimental groups(P<0.05),but the differences between Group B and Group C, Group D and Group E are not significant；D：The TNF-α concentration in intestine between control and trail groups were significant(P<0.05), LPS intraperitoneal injection higher than oral administration, the TNF-α concentration is positive corrective with the dose of LPS(P<0.05).

圖2 不同病理損傷程度的典型實(shí)體圖及HE染色圖(HE染色 ×200)注： A：0分，腸管呈粉紅色、有光澤，瑞蠕動(dòng)良；B：1分，輕度粘膜下腫脹和絨毛輕度受損；C：2分，腸管擴(kuò)張，嚴(yán)重梗阻，腸壁積氣； D：3分，腸管嚴(yán)重?cái)U(kuò)張，黑死；E：4分，嚴(yán)重壞死、腸穿孔、腹水；F：腸黏膜絨毛完整，結(jié)構(gòu)正常；G：上皮脫落僅限于絨毛頂部； H：絨毛中部以上損傷壞死；I：絨毛缺失，隱窩仍可識別；J：黏膜上皮結(jié)構(gòu)完全缺失，或透壁壞死Fig.2 Typical characteristics of gross morphology and HE staining (0, 1, 2, 3, 4 points)Note：A：NEC score 0, The normal intestinal tract was carnation and glossy, intestinal canal moved actively; B：1, Slightly congested disclosed; C：2, Sight dilatation, severe congested; D：3, Extensive dilatation, appeared black；E：4, Severe necrosis, extensive discoloration; F：NEC score 0, normal ileum; G：1, slight submucosal separation and villus tip injury; H：2, villas failed off; I：3, mucosa grew swelling and villus sever injury, severe separation of submucosa and/or lamina propria edema in submucosa; J：4,transmural necrosis

3 討 論

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)是新生兒期常見的致死性疾病。自1967年首次報(bào)道并被普遍認(rèn)識以來，盡管圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)取得了很大發(fā)展，早產(chǎn)兒成活率明顯提高，但NEC的發(fā)病及預(yù)后仍無明顯改善。目前，出生體質(zhì)量在500～1 500 g之間的新生兒NEC的發(fā)病率高達(dá)7%，NEC相關(guān)死亡率達(dá)20%～30%，嚴(yán)重NEC需手術(shù)治療的患兒死亡率更高[4]。目前研究認(rèn)為早產(chǎn)、不適當(dāng)?shù)奈改c喂養(yǎng)、缺氧缺血損傷及腸道菌群失調(diào)、移位導(dǎo)致腸道異常的免疫反應(yīng)是NEC發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5]。NEC的確切病因、病理機(jī)制仍不明確，亟需進(jìn)一步研究。

動(dòng)物模型在NEC病因及病理機(jī)制的研究中起著非常重要的作用，許多學(xué)者探索不同的NEC模型建立方法，但該模型建立方法至今仍不統(tǒng)一[6]。人工喂養(yǎng)、缺氧、復(fù)氧、冷刺激、LPS等單一的建模方法穩(wěn)定性、可重復(fù)性較差；而綜合早產(chǎn)、人工喂養(yǎng)、缺氧冷刺激、LPS灌胃或腹腔注射的造模方法應(yīng)用越來越普遍[7]。但各研究報(bào)道在缺氧時(shí)間(3～10 min)，4 ℃冷刺激時(shí)間(5～10 min)、LPS用法(經(jīng)胃腸道、腹腔注射)用量(2～10 mg/kg)方面仍存在較大差異[8-10]。故本實(shí)驗(yàn)參考目前普遍應(yīng)用的建模方法，進(jìn)一步改進(jìn)、比較不同建模結(jié)果，以期優(yōu)化建模條件。

新生大鼠是NEC模型最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，屬“晚發(fā)育性動(dòng)物”，1日齡新生鼠相當(dāng)于22～24周早產(chǎn)兒、3日齡相當(dāng)于28～32周早產(chǎn)兒發(fā)育水平[11-12]，故推測新生鼠可以模擬早產(chǎn)兒建立NEC模型，本實(shí)驗(yàn)鼠采用出生2 h內(nèi)未開奶新生SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)鼠。喂養(yǎng)方面，新生鼠，尤其是早產(chǎn)鼠，食管插管灌胃操作難度極大，食管穿孔、氣胸、胃穿孔等并發(fā)癥發(fā)生率高，預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，食管插管明顯增加實(shí)驗(yàn)鼠的死亡率。故本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上做適當(dāng)調(diào)整，利用喂養(yǎng)管刺激新生鼠口咽部，引出新生鼠的吞咽反射，緩慢注入代乳品，可達(dá)到喂養(yǎng)目的，同時(shí)可減少新生鼠因喂養(yǎng)所致的非NEC相關(guān)性死亡，提示試驗(yàn)的穩(wěn)定性。

最新研究認(rèn)為TLR4作為LPS受體，可促進(jìn)異常強(qiáng)烈的嚴(yán)重反應(yīng)、誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞自噬、凋亡并抑制其增殖、遷移繼而抑制小腸損傷修復(fù)能力，在NEC的發(fā)病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[8, 10, 13]， LPS在NEC模型建立中的應(yīng)用得到認(rèn)可并普遍應(yīng)用。但其用法、用量并不統(tǒng)一，本實(shí)驗(yàn)比較人工喂養(yǎng)、缺氧冷刺激結(jié)合口服或腹腔注射兩種常用不同劑量LPS的造模方法，經(jīng)胃腸道組(B、C)之間在死亡率、NEC發(fā)病率、NEC評分方面，差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。D、E組比較發(fā)現(xiàn)，LPS 5 mg/kg腹腔注射，新生鼠在3～6 h開始出現(xiàn)煩躁、尖叫，繼而全身皮膚黏膜蒼白、青紫等嚴(yán)重膿毒血癥癥狀，且12 h內(nèi)死亡率為3/20，解剖后病理證實(shí)NEC評分均小于2分，故認(rèn)為非NEC相關(guān)性死亡；既往有研究也發(fā)現(xiàn)，注射LPS(5 mg/kg)可導(dǎo)致大鼠肝、腎、肺出現(xiàn)嚴(yán)重的出血壞死，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)鼠直接死亡[14]，本試驗(yàn)B、C、D組中新生鼠非NEC死亡分別為1、2、5只，雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(PDE=0.2)，但不排除受樣本量較小的影響；綜合分析認(rèn)為LPS高劑量腹腔注射，可能誘發(fā)全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、肺出血、多器官功能衰竭(MODF)，而NEC病變尚未充分顯現(xiàn)，增加了非NEC致死率，導(dǎo)致NEC發(fā)生率及NEC病理評分呈“假性降低”，故D、E組間病理評分無差異，但死亡率(P=0.027)、生存分析(P=0.04)結(jié)果顯示兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,結(jié)果提示增加LPS腹腔注射劑量并不能提高NEC 的發(fā)病率，而且由此誘發(fā)的并發(fā)癥可能增加實(shí)驗(yàn)鼠的死亡率。

通過生存分析、NEC發(fā)生率、NEC相關(guān)性死亡率、NEC非相關(guān)性死亡率、NEC病理評分、小腸內(nèi)炎癥因子變化方面綜合分析，認(rèn)為新生鼠結(jié)合人工喂養(yǎng)、缺氧冷刺激、小劑量(2 mg/kg)LPS腹腔注射是建立NEC較為理想的方法。在NEC模型建立及試驗(yàn)結(jié)果分析過程中應(yīng)該重點(diǎn)評價(jià)小腸病理性損傷程度，同時(shí)納入實(shí)驗(yàn)鼠的生存情況綜合性分析，盡可能防止假陰性或假陽性結(jié)果出現(xiàn)。

目前壞死性小腸結(jié)腸炎的病因及病理機(jī)制仍不完全,不明確，部分研究認(rèn)為消化系統(tǒng)黏膜屏障損傷后繼發(fā)性感染和膿毒血癥是主要的病理過程[15]，但目前所有的動(dòng)物模型建立方法主要通過系統(tǒng)性刺激而建立腸壞死病變，經(jīng)消化道給予LPS的結(jié)果穩(wěn)定性較差，成功率較低，隨著對NEC病理生理機(jī)制研究的不斷深入，改模型的建立方法應(yīng)需要進(jìn)一步改進(jìn)和完善，以更好地模擬臨床病例生理過程。