鐘克焱，甘楊子

（海南醫(yī)學(xué)院，海南?？?571199）

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在飼養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中常使用抗生素，這不可避免地會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液中存在抗生素及其代謝產(chǎn)物會(huì)殘留一段時(shí)間，這可能會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)[1]。有抗生素殘留的動(dòng)物本身并不是合格的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，抗生素殘留可能會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。因此，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中的抗生素殘留檢測(cè)，主要采用液相色譜、質(zhì)譜分析等，但是這些分析方法更適合進(jìn)行量化分析，同時(shí)價(jià)格也相對(duì)更高。微生物法檢驗(yàn)是一種傳統(tǒng)經(jīng)典的測(cè)定方法，其利用抗生素對(duì)微生物的生理機(jī)能、代謝的抑制作用，與陰性對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，反映待測(cè)樣本中是否存在抗生素殘留。微生物檢測(cè)法包括括紙片法、TTC法、管碟法、試劑盒檢測(cè)法，這些方法操作簡(jiǎn)單，可供選擇的是檢測(cè)試劑材料豐富，可讀性強(qiáng)，許多甚至通過(guò)肉眼便可以觀看微生物的孢子萌發(fā)是否受到抑制，從而判斷是否存在抗生素殘留。本文嘗試采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中的抗生素殘留，為抗生素殘留檢測(cè)方法建立提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備、材料

選擇實(shí)驗(yàn)室SD大鼠，數(shù)量不限，麻醉后取股動(dòng)脈血，-4 ℃保存，獲得血液100份，每只1 mL。嗜熱脂肪芽孢桿菌，青霉素等抗生素，甲苯胺藍(lán)，MRS肉湯培養(yǎng)基等。電子天平，電熱恒溫水浴鍋，酸度計(jì)，生化培養(yǎng)箱，生物學(xué)顯微鏡，不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋等。

1.2 方法

以嗜熱脂肪芽孢桿菌作為檢測(cè)菌種，根據(jù)藥典中有關(guān)于抗生素殘留微生物檢測(cè)方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，參照管碟法檢測(cè)不同抗生素的檢測(cè)限，以新生大鼠血清作為陰性對(duì)照。以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的獸用抗生素的有效含量?？股貥?biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及工作溶液的稀釋劑的選擇參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法中所用稀釋劑。采用嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法制備含有不同抗生素含量的血液樣品，以檢出陽(yáng)性的最低限度抗生素濃度作為嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法對(duì)該種抗生素的檢出限。分別采用LPLC-MS/MS、嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法檢測(cè)隨機(jī)獲得的415份實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液，以LPLC-MS/MS作為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法檢測(cè)抗生素殘留效用。

1.3 觀察指標(biāo)

LPLC-MS/MS測(cè)定的商品抗生素含量、嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法測(cè)定抗生素的檢出限度。實(shí)測(cè)過(guò)程LPLC-MS/MS法。

2 結(jié)果

2.1 檢出限比較

LPLC-MS/MS測(cè)定的商品抗生素含量、嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法測(cè)定抗生素的檢出限度如下，見(jiàn)表1。

2.2 實(shí)測(cè)

以LPLC-MS/MS作為金標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定415份實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液樣本，其中陽(yáng)性72例、陰性343例，嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法的靈敏度84.7%（61/72）、特異度99.1%（340/343）、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值95.3%（61/64）、陰性預(yù)測(cè)值96.9%（340/351）、符合率96.6%（401/415）。

表1 兩種方法測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液中抗生素的檢出限度

3 討論

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清抗生素殘留的檢測(cè)是實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理的重要組成部分，可以反應(yīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)機(jī)構(gòu)的飼養(yǎng)情況、質(zhì)控水平[2-3]。微生物法是抗生素殘留檢測(cè)重要方法，但是精度常無(wú)法讓人滿意，需要明確檢測(cè)限度，建立檢測(cè)體系。本文選擇指南推薦的嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法進(jìn)行研究，以LPLC-MS/MS作為金標(biāo)準(zhǔn)，嘗試建立嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法檢測(cè)體系。

研究顯示，微生物法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中的抗生素殘留的效用尚可，盡管不如LPLC-MS/MS法，但是基本可以滿足部分抗生素檢測(cè)的需求，可以作為快速檢測(cè)法。以金標(biāo)準(zhǔn)作為檢測(cè)對(duì)照，嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法的靈敏度84.7%、特異度99.1%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值95.3%、陰性預(yù)測(cè)值96.9%、符合率96.6%，反映了嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法可以快速檢測(cè)抗生素殘留，且效用較好，從檢出效率來(lái)看，理想狀態(tài)下與LPLCMS/MS法接近。從檢出限度大小變化來(lái)看，該方法與LPLC-MS/MS法檢測(cè)限度有相關(guān)性，即抑菌法檢測(cè)限度越高，一般LPLC-MS/MS法限度也越高，但嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法對(duì)頭孢噻呋鈉、芐星青霉親、紅霉素的檢測(cè)限度較低，這與檢測(cè)菌的耐藥性、受抑制抗生素作用的特性有關(guān)[4]。

但需注意的是，研究中，嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法對(duì)各類抗生素殘留檢測(cè)限度在3～70ng/g之間，存在較大的差異。本次研究中嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法對(duì)頭孢氨芐等抗生素的檢出限度較高，這反映了微生物抑制法存在固有的缺陷，檢測(cè)精度達(dá)不到國(guó)家的要求。因此，在選擇檢測(cè)菌時(shí)，需盡量選擇那些耐藥性較低、對(duì)抗生素普遍敏感的微生物，如嗜熱脂肪芽孢桿菌。也可以嘗試聯(lián)合其他微生物抑菌法，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌檢出限度較高的頭孢噻呋鈉、芐星青霉親、紅霉素等抗生素敏感的指示菌，建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抗生素殘留的檢測(cè)體系，以覆蓋絕大多數(shù)的獸用抗生素。當(dāng)然，不同實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的來(lái)源不同，對(duì)質(zhì)量要求也不同，建立抗生素殘留檢測(cè)體系需要根據(jù)自身的實(shí)際需要[4-5]。

本次研究也存在許多不足之處，實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果是理想條件下單一抗生素殘留檢測(cè)。在實(shí)踐過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)可能會(huì)存在多種抗生素，這些抗生素混雜會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果，嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法對(duì)于多種抗生素殘留檢測(cè)效果并不理想[6-7]。

4 小結(jié)

微生物法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中的抗生素殘留的效用尚可，盡管不如LPLC-MS/MS法，但是基本可以滿足檢測(cè)的需求，可以作為抗生素含量快速檢測(cè)。