武平

（山西醫(yī)科大學(xué)晉祠學(xué)院，山西太原 030025）

胃癌屬于惡性腫瘤的一種，其發(fā)生率較高，并具有較高的致死率，嚴(yán)重威脅患者的健康及安全[1]。研究顯示，晚期胃癌患者死亡的一項(xiàng)重要原因即腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移。因此，了解胃癌的發(fā)生情況，同時(shí)分析其侵襲、轉(zhuǎn)移機(jī)制，可為該病患者的治療提供有效參考[2-3]。Snail是一種鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，該因子在多種腫瘤疾病中均可發(fā)揮一定作用[4]。本研究就轉(zhuǎn)錄因子Snail對(duì)胃癌MKN-28細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲的影響進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

自上海細(xì)胞庫(kù)選購(gòu)胃癌MNK-28細(xì)胞株，選取基爾頓公司合成的慢病毒構(gòu)建針對(duì)Snail設(shè)計(jì)的shRNA載體；同時(shí)選取CCK-8試劑盒（生產(chǎn)廠家：凱基公司）、Transwell小室（生產(chǎn)廠家：康寧公司），順鉑及其他試劑、培養(yǎng)基均由博爾美公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

于37 ℃、5%二氧化碳水平下，以PRMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）對(duì)MNK-28細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；嚴(yán)密觀察細(xì)胞情況、定時(shí)換液，細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)以胰酶消化處理，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 篩選藥物濃度

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌MNK-28細(xì)胞株，將選取的細(xì)胞株加至96孔板中，每孔加入100 μL懸濁液，密度設(shè)置為1×104個(gè)/mL，連續(xù)培養(yǎng)24 h；分別在孔中加入2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL的順鉑，培養(yǎng)時(shí)間分別為12 h、24 h、48 h；同時(shí)每孔中加入10 μL CCK-8；然后于37 ℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培育2 h，之后利用酶標(biāo)儀進(jìn)行450 nm波長(zhǎng)的吸光度值（OD值）測(cè)定；每組細(xì)胞均分別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 細(xì)胞增殖情況觀察

細(xì)胞增殖情況以CCK-8法觀察，在96孔板中加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKN-28細(xì)胞，每孔中加入細(xì)胞懸液100 μL，確保每孔細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL；并設(shè)置復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，之后加入順鉑、shRNA+Snail、shRNA+Snail+順鉑等處理因素，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)；每孔加入10 μL CCK-8，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，以空白對(duì)照標(biāo)零，利用酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度值測(cè)定。

1.2.4 細(xì)胞凋亡情況觀察

以電鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，在96孔板中加入密度為4×105個(gè)/mL的MKN-28細(xì)胞，并加入相關(guān)刺激因素，培養(yǎng)48 h，以胰酶消化細(xì)胞，離心10 min，棄上清液，以Palade緩沖液進(jìn)行2次洗滌，洗滌后在1%鋨酸中懸浮細(xì)胞，固定于4 ℃環(huán)境下1 h，再以相同緩沖液進(jìn)行洗滌2次。之后進(jìn)行脫水處理，脫水后在丙酮/包埋劑置換30 min，置換后在包埋劑中浸潤(rùn)2 h，之后進(jìn)行包埋、切片、染色等處理，最后于電子顯微鏡下對(duì)細(xì)胞情況進(jìn)行觀察。

1.2.5 細(xì)胞侵襲情況觀察

對(duì)細(xì)胞侵襲情況進(jìn)行分析，觀察方式選用Transwell小室，收集經(jīng)相關(guān)因素刺激后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個(gè)/mL，在Transwell小室上部接種，在37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)24 h；之后將Transwell膜取出，反復(fù)洗滌，并用4%多聚甲醛固定15 min，用0.1%結(jié)晶染色10 min；最后于顯微鏡下進(jìn)行拍照觀察，統(tǒng)計(jì)穿過(guò)Transwell膜的細(xì)胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行處理，計(jì)量資料“±”以t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料（%）以χ2檢驗(yàn)，p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物濃度篩選結(jié)果分析

以酶標(biāo)儀進(jìn)行OD值測(cè)量，以O(shè)D值表示細(xì)胞存活率，MKN-28細(xì)胞在經(jīng)不同濃度的順鉑培養(yǎng)48 h后，其細(xì)胞存活率均明顯降低，且隨著順鉑濃度的增加，其細(xì)胞存活率逐漸下降。經(jīng)分析，于5 μg/mL、作用48 h時(shí)殺傷效率最理想，見(jiàn)表1。

表1 藥物濃度篩選結(jié)果

2.2 沉默Snail基因?qū)NK-28細(xì)胞增殖情況的影響

經(jīng)CCK-8法對(duì)各組MNK-28細(xì)胞增殖能力進(jìn)行觀察，以O(shè)D值表示細(xì)胞增殖能力，作用48 h后進(jìn)行比較，順鉑處理及慢病毒沉默Snail基因均可見(jiàn)細(xì)胞增殖抑制現(xiàn)象，而shRNA+Snail+順鉑組細(xì)胞增殖抑制率顯著高于其他組（p＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 沉默Snail基因?qū)NK-28細(xì)胞增殖情況的影響

2.3 沉默Snail基因?qū)NK-28細(xì)胞凋亡的影響

于電鏡下對(duì)細(xì)胞凋亡情況觀察分析，可以觀察到內(nèi)皮網(wǎng)明顯稀疏，細(xì)胞質(zhì)明顯濃縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)稀疏，并和細(xì)胞膜融合形成空泡，細(xì)胞核也明顯縮小，同時(shí)線粒體體積變大，并可見(jiàn)已凋亡細(xì)胞發(fā)生裂解，構(gòu)成凋亡小體。shRNA+Snail+順鉑組凋亡小體相較于其他組別，表現(xiàn)地更為明顯，見(jiàn)圖1。

圖1 細(xì)胞凋亡情況觀察

2.4 沉默Snail基因?qū)NK-28細(xì)胞侵襲情況的影響

以Transwell小室觀察細(xì)胞侵襲情況，以穿過(guò)Transwell膜的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行表示，以O(shè)D值進(jìn)行計(jì)數(shù)，shRNA+Snail+順鉑組細(xì)胞遷出的細(xì)胞數(shù)較其他組明顯降低（p＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 沉默Snail基因?qū)NK-28細(xì)胞侵襲情況的影響

3 討論

胃癌屬于惡性腫瘤性疾病的一種，起源于胃黏膜上皮，其發(fā)生率較高，占據(jù)了我國(guó)各種腫瘤的首位[5]。該病患者多為50歲以上的中老年人群，且男性的發(fā)生率約為女性的2倍[6]。近年來(lái)，隨著人們生活習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)的改變及工作壓力的增大，該病的發(fā)生率呈明顯增長(zhǎng)趨勢(shì)。該病發(fā)生早期通常無(wú)明顯癥狀，極易被患者忽略，多數(shù)患者就診時(shí)已處于晚期狀態(tài)。手術(shù)是目前臨床上治療胃癌的常用方式，但術(shù)后患者復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率較高，通?？蛇_(dá)到40%～60%。而胃癌轉(zhuǎn)移屬于胃癌的重要特征，是導(dǎo)致患者死亡的重要因素[7]。故而加強(qiáng)對(duì)胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的研究非常重要。

Snail屬于鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子的一種，定位于人類染色體20q12.3。有研究表明，Snail在小鼠結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞凋亡及增殖中發(fā)揮著重要作用。同時(shí)有研究顯示[8]，Snail能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白CyclinD2，且其異常表達(dá)還可能會(huì)影響p53及一些促凋亡因子表達(dá)情況，進(jìn)而可對(duì)腫瘤生長(zhǎng)造成影響。

本次研究分析了Snail對(duì)胃癌MKN-28細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的影響，結(jié)果顯示順鉑處理及慢病毒沉默Snail基因均可見(jiàn)細(xì)胞增殖抑制現(xiàn)象，而shRNA+Snail+順鉑組其細(xì)胞增殖抑制率顯著高于其他組（p＜0.05）；與單純MKN-28細(xì)胞組比較，不同刺激因素組細(xì)胞凋亡程度均顯著升高（p＜0.05）；這說(shuō)明，Snail可對(duì)胃癌MKN-28細(xì)胞的增殖與凋亡造成影響。

胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移與浸潤(rùn)屬于復(fù)雜過(guò)程，常會(huì)涉及較多方面，如細(xì)胞自原發(fā)病灶中脫落，并將基底膜浸潤(rùn)、穿透，細(xì)胞之間黏附力不同，可對(duì)浸潤(rùn)造成影響[9]等。從實(shí)質(zhì)上說(shuō)，癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是黏附和去黏附的交替過(guò)程，其和E-cadherin的表達(dá)之間密切相關(guān)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換則在胚胎時(shí)期器官發(fā)育過(guò)程中承擔(dān)著重要職責(zé)，和腫瘤局部浸潤(rùn)、侵襲能力均有較大關(guān)聯(lián)，而E-cadherin為上皮細(xì)胞的關(guān)鍵分子，其表達(dá)水平下降則為其典型表現(xiàn)，Snail基因則可對(duì)其表達(dá)情況進(jìn)行調(diào)節(jié)[10]。本次研究結(jié)果顯示，經(jīng)Snail基因調(diào)節(jié)后，各組細(xì)胞侵襲能力均有所下降，且shRNA+Snail+順鉑組細(xì)胞遷出的細(xì)胞數(shù)較其他組明顯降低（p＜0.05）；提示Snail可在一定程度上對(duì)細(xì)胞侵襲能力造成影響，而Snail可能會(huì)在一定程度上提高順鉑的活性。

綜上所述，轉(zhuǎn)錄因子Snail可對(duì)胃癌MKN-28細(xì)胞的增殖情況產(chǎn)生影響，沉默Snail基因有利于加速細(xì)胞凋亡，提高化療藥敏感性，有較好的臨床應(yīng)用前景。