朱藝恒，潘紅菊，汪涯

（1.江西師范大學(xué)附屬中學(xué)，江西南昌330046；2江西科技師范大學(xué)生物加工過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330013）

南豐蜜橘是江西的名優(yōu)特產(chǎn)，因其果香濃郁、汁多味美、香甜可口、營(yíng)養(yǎng)豐富而備受人們喜愛(ài)。蜜橘鮮果多在每年的11月、12月集中上市，且皮薄柔嫩，不耐運(yùn)輸和倉(cāng)儲(chǔ)，極易腐敗變質(zhì)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。筆者前期在江西南豐縣的蜜橘果園采風(fēng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，腐敗的蜜橘會(huì)散發(fā)出一種獨(dú)特蜜橘風(fēng)味的酸味，極有可能是某類(lèi)產(chǎn)酸（醋酸）的微生物發(fā)酵所致。試想，如能開(kāi)發(fā)利用這些產(chǎn)酸微生物，將其運(yùn)用在產(chǎn)酸的蜜橘發(fā)酵飲料等果蔬深加工領(lǐng)域，不僅能促進(jìn)我國(guó)的蜜橘等果蔬加工利用水平，而且對(duì)于解決農(nóng)民增產(chǎn)不增收問(wèn)題，增強(qiáng)農(nóng)戶(hù)種植蜜橘積極性，都具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。鑒于此，本研究擬對(duì)江西南豐蜜橘果園內(nèi)自然衰老腐敗后略帶酸性氣味的蜜橘進(jìn)行采集，對(duì)其中產(chǎn)醋酸的菌株進(jìn)行初步的分離純化，并對(duì)其生長(zhǎng)特性進(jìn)行初步研究，以期篩選獲得南豐蜜橘中優(yōu)良的產(chǎn)醋酸菌株資源，為發(fā)酵性蜜橘果飲的開(kāi)發(fā)提供菌種支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

供試南豐蜜橘于2017年11月采集自江西省南豐縣南豐蜜橘果園，選取無(wú)明顯病灶自然衰老腐敗且散發(fā)酸性氣味的蜜橘，置于冰袋中帶回實(shí)驗(yàn)室24 h內(nèi)完成菌種分離。

1.2 儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)（蘇州安泰）、生化培養(yǎng)箱（天津市泰斯特）、恒溫培養(yǎng)振蕩箱（上海智城）、滅菌鍋（新華醫(yī)藥）、電子天平（梅特勒）、紫外/分光光度計(jì)（Lambda 365 UV-VIS，上海佑科）、生物顯微鏡（尼康）、電泳儀（北京市六一儀器廠）、高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀）、PCR擴(kuò)增儀（伯樂(lè)）、凝膠圖像分析系統(tǒng)（美國(guó)西盟）。

1.3 培養(yǎng)基

菌株富集培養(yǎng)基配方為：10 g/L酵母膏、10 g/L葡萄糖、5mg/L制霉菌素、4%無(wú)水乙醇；菌株分離和保藏培養(yǎng)基配方為：15 g/L CaCO3、10 g/L酵母膏、10 g/L葡萄糖、1.8%瓊脂粉、4%無(wú)水乙醇；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為：10 g/L酵母膏、10 g/L葡萄糖、4%無(wú)水乙醇，所有培養(yǎng)基的pH均為自然。

1.4 菌株分離純化

將采集的蜜橘樣品用無(wú)菌水清洗3～5次，用75%酒精擦拭表面30～60 s，去皮后放入無(wú)菌的碾缽內(nèi)碾磨，取10 mL汁液接入含50 mL富集培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，置于32℃、150 r/min的搖床種富集培養(yǎng)48 h。取富集培養(yǎng)液進(jìn)行對(duì)倍梯度稀釋?zhuān)瑢?0-3和10-5的樣品稀釋液接入分離平板進(jìn)行涂布培養(yǎng)，32℃恒溫培養(yǎng)72 h。挑取能再分離平板上生長(zhǎng)且有透明圈的菌株進(jìn)行純化培養(yǎng)3代，4 ℃試管斜面保藏，用于后續(xù)定性篩選。

1.5 菌株定性篩選及形態(tài)特征

參考蘇龍等[2]的方法進(jìn)行產(chǎn)醋酸的定性分析。將上述分離獲得的菌株進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，離心取上清液1 mL加入19 mL無(wú)菌水混勻后，用0.05 mol/LNaOH調(diào)pH至7.0，加入50 g/L FeCl3溶液4～6滴混勻，如形成黃褐色沉淀，且加熱至沸騰仍出現(xiàn)紅褐色沉淀，則供試菌種為產(chǎn)醋酸菌株。將定性篩選確定為產(chǎn)醋酸的菌株接種在發(fā)酵培養(yǎng)基上，對(duì)其菌落形態(tài)進(jìn)行觀測(cè)；采用革蘭氏染色法，對(duì)菌株的顯微形態(tài)進(jìn)行觀察。

1.6 菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析

采用細(xì)菌DNA提取試劑盒并按其操作說(shuō)明提取產(chǎn)醋酸菌株的總DNA。電泳檢測(cè)后選用細(xì)菌16S rDNA的通用引物27F（5’-AGAGTTTGA TCMTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGYTACCTTGT TACGACTT-3’）對(duì)菌株的16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為20 μL PCD Mix，正向和反向引物各2 μL，1μL模板DNA及15 μLddH2O；反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性2min，95 ℃復(fù)性30s，55 ℃延伸30s，72 ℃退火90s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸5min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物條帶后送上海生工進(jìn)行測(cè)序。將所得序列提交NCBI數(shù)據(jù)進(jìn)行Blast比對(duì)分析，選取并下載與供試菌株序列最為相近的菌株序列，利用MEGA 7構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，對(duì)菌株進(jìn)行分子鑒定。

1.7 菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)醋酸特性

將菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基后，至于32 ℃、150r/min的搖床中培養(yǎng)7～10 d，期間每日測(cè)定菌株的生長(zhǎng)情況，以O(shè)D600的數(shù)值指示菌體濃度。菌株產(chǎn)醋酸的定量測(cè)定參考涂佳等[3]的方法。取發(fā)酵液進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)渭?.5%酚酞為指示劑，用0.05 mol/L NaOH溶液滴定至終點(diǎn)（淺粉色），記錄NaOH的用量并換算為醋酸的含量，其中對(duì)照組為空白培養(yǎng)基滴定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離篩選

共計(jì)從自然腐敗帶酸性氣味的南豐蜜橘樣品中分離獲得3株細(xì)菌，選取梯度稀釋至10-4的富集培養(yǎng)液樣品涂布平板分離效果最好，生長(zhǎng)出來(lái)的單個(gè)菌落能均勻分布在分離平板上（圖1A），且添加的制霉菌素也能較好地抑制霉菌等的污染。挑取不同菌落形態(tài)的菌株進(jìn)行3～5代純化后，生長(zhǎng)在發(fā)酵培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)如表1所示，菌落表面均濕潤(rùn)光滑，易挑取，編號(hào)為NF-1、NF-2和NF-3的菌株的顏色有一些差異，將菌株分別保藏后進(jìn)行產(chǎn)醋酸定性分析。

2.2 產(chǎn)醋酸菌株的定性分析及形態(tài)特征

圖1 南豐蜜橘中產(chǎn)醋酸菌的分離篩選及菌株NF-1形態(tài)特征圖譜

表1 南豐蜜橘中產(chǎn)醋酸菌的分離篩選結(jié)果

通過(guò)產(chǎn)醋酸顯色沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)行定性驗(yàn)證分析發(fā)現(xiàn)，編號(hào)為NF-2和NF-3菌株不能在分離平板中形成透明溶解CaCO3的暈圈，且在FeCl3溶液里沒(méi)有顏色變化和沉淀產(chǎn)生，表明它們不能產(chǎn)醋酸。菌株NF-1既可在分離平板中形成透明的暈圈（圖1B），也能在FeCl3溶液里形成穩(wěn)定的紅褐色沉淀（圖1C），表明其可代謝產(chǎn)生醋酸。菌落形態(tài)觀察結(jié)果顯示，菌株NF-1菌落圓形，顏色灰白色，表面濕潤(rùn)，易挑取，菌落質(zhì)地均一、光滑，革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其為革蘭氏陰性菌株（圖1D）。

2.3 菌株NF-1的分子鑒定

采用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增其16S rDNA序列后電泳檢測(cè)有清晰的條帶，表明PCR擴(kuò)增成功，便送往上海生工公司測(cè)序。將測(cè)序后的序列提交NCBI數(shù)據(jù)進(jìn)行Blast比對(duì)分析，結(jié)果顯示，菌株NF-1與數(shù)據(jù)庫(kù)中的葡糖醋桿菌Gluconacetobacter sp. SC-01相似度最高，可達(dá)99%。進(jìn)一步下載數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)最為接近的不同種類(lèi)的菌株序列，基于NF-1菌株的16S rDNA序列構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示，菌株NF-1與葡糖醋桿菌屬Gluconacetobacter的菌株進(jìn)化關(guān)系較近，可與Gluconacetobacter sp. SC-01聚類(lèi)在一枝，綜合以上分析，將菌株NF-1鑒定為葡糖醋桿菌Gluconacetobacter，暫命名為Gluconacetobactersp. NF-1。

圖2 基于細(xì)菌16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析圖譜

2.4 菌株NF-1搖瓶發(fā)酵產(chǎn)醋酸

采用比濁法對(duì)菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，菌株NF-1生長(zhǎng)快速，在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)約2 d時(shí)菌體生長(zhǎng)達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定階段，進(jìn)入穩(wěn)定期，OD600數(shù)值也趨于平緩。但隨后菌株的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的增加，直到發(fā)酵6 d后，菌株的生長(zhǎng)再次呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，推測(cè)其原因可能是發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的醋酸對(duì)菌株的生長(zhǎng)造成了影響，經(jīng)過(guò)醋酸的不斷誘導(dǎo)后，菌株適應(yīng)了含有醋酸的環(huán)境，表現(xiàn)為繼續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)。發(fā)酵過(guò)程中醋酸的產(chǎn)量曲線(xiàn)顯示，發(fā)酵5 d后醋酸的產(chǎn)量最高，可達(dá)（31.65±1.48）g/L。菌株NF-1代謝積累醋酸的含量與菌株細(xì)胞本身的不斷生長(zhǎng)趨勢(shì)是一致的，即醋酸的積累與菌株細(xì)胞的生長(zhǎng)是生長(zhǎng)相關(guān)型。

圖3 菌株NF-1搖瓶發(fā)酵生長(zhǎng)及產(chǎn)酸圖譜

3 結(jié)論

開(kāi)展果蔬發(fā)酵功能菌株的自然選育和菌種資源庫(kù)的建立工作，對(duì)提升我國(guó)的果蔬深加工水平具有重要意義。本文報(bào)道了從自然腐敗的南豐蜜橘中分離純化產(chǎn)醋酸的菌株，通過(guò)平板分離初篩和產(chǎn)醋酸的定性分析，結(jié)果從分離獲得的3株細(xì)菌中篩選得到1株可代謝產(chǎn)醋酸的菌株NF-1。結(jié)合細(xì)胞形態(tài)和16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果，將其鑒定為葡糖醋桿菌屬，暫命名為Gluconacetobactersp. NF-1。搖瓶發(fā)酵的結(jié)果顯示，其細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)醋酸的過(guò)程為生長(zhǎng)相關(guān)型，其在發(fā)酵6 d后醋酸的產(chǎn)量可達(dá)（31.65±1.48）g/L。本研究不但為后續(xù)優(yōu)化菌株NF-1高產(chǎn)醋酸發(fā)酵工藝奠定了基礎(chǔ)，還可以為開(kāi)發(fā)南豐蜜橘中優(yōu)良的產(chǎn)醋酸菌種資源和研制新型發(fā)酵性蜜橘果飲提供參考。