陳麗娜，秦瑤，孫成丹，王晶，劉春明*

（1.長春師范大學，吉林長春130032；2.北京知蜂堂健康科技股份有限公司，北京 102200）

玫瑰花含有豐富鞣質、原花青素、黃酮、維生素C及人體所需的多種氨基酸和微量元素[1-4]，具有通經活血、美容養(yǎng)顏等功效，被作為花茶和食材廣泛使用。隨著人們對食用玫瑰花需求的增加，栽培面積越來越大。玫瑰花栽培過程中常見銹病、黑莓病、白粉病等疾病以及玫瑰莖葉蜂、玫瑰中夜蛾、吹綿蚧及紅蜘蛛等害蟲[5-6]，因此需適當噴灑農藥已進行預防和治療。但如果使用不合理，任意加大農藥的噴施濃度或施藥后未按安全間隔期采收，都會造成農藥殘留污染問題[7-8]。

液相色譜-串聯質譜技術由于具有靈敏度高、抗干擾能力強等優(yōu)點成為農藥殘留檢測的主要工具之一。超高效液相色譜-串聯質譜技術在此基礎上進一步縮短了分析時間，提高了工作效率[9]。QuEChERS方法是一種集提取與凈化為一體的樣品前處理方法，在農產品的農殘分析中具有很好的應用前景[10]。

本實驗對QuEChERS進行了適當改進，研究了應用UPLC-MS/MS分析玫瑰花中19種常用農藥殘留的測定方法。并應用此方法對實際樣品進行了分析，獲得了較好的分析結果。

1 實驗部分

1.1 藥品與試劑

玫瑰花樣品，購買于長春中東萬家大藥房。UPLC所用的流動相乙腈（色譜純，Fisher，美國），甲酸、乙酸（色譜純, 阿拉?。?；N-丙基乙二胺（PSA）、C18與石墨化碳粉末（GCB），均購于Agela公司；氯化鈉（NaCl）、無水硫酸鎂（MgSO4）、乙酸銨（NH4OAc）、乙酸鈉（NaAc）為分析純購自北京化工廠，NaCl于120 ℃條件下在馬弗爐中加熱5 h，無水MgSO4在650 ℃條件下加熱4 h；農藥標準物質的純度＞95%，均購自于Dr.EhrenstorferGmbH公司；實驗用水為超純水。

1.2 實驗儀器

UPLC-MS/MS（ACQUITY UPLC, Xevo TQ-S,Waters公司），配有ESI離子源，三級四極桿質量分析器；Acquity UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters公司）；離心機（3K30，Sigma公司）；渦旋混合器（QiLinBeier5，科學儀器廠）；氮氣吹干儀（YGC-24，鄭州寶晶公司），超純水制備儀（LabostarTMTWT UV7，SIEMENS公司）。

1.3 UPLC-MS/MS分析條件

利用Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（50mm×2.1 mm，1.7 μm）分離；流動相A為乙腈，流動相B為0.01%甲酸水溶液，采用梯度洗脫程序：0～3.0 min，10%～30% A；3.0～6.0 min，30%～50% A；6.0～6.5 min，50%～80% A；6.5～7.5 min，80%～95% A；7.5～9.0 min，95%～95% A；9.0～10.0 min，95%～10% A；10.0～12.0 min，10%～10%A。流速：0.3 mL/min；柱溫：30℃；進樣體積：5.0 μL。

UPLC系統配有三級四極桿質譜，離子源為電噴霧電離離子源（ESI），正離子掃描，多反應離子監(jiān)測模式（MRM）進行分析，質譜操作參數如下：毛細管電壓1.0 kV，離子源溫度120℃，脫溶劑氣溫度350 ℃，脫溶劑氣流量700 L/h，錐孔氣流量150 L/h，碰撞氣流量0.15 L/h。

1.4 樣品的前處理方法

稱取2 g玫瑰花樣品于50 mL的離心管中，并向其中加入10 mL的超純水及10 mL含有0.1%乙酸的乙腈，渦旋混勻1 min；稱取4 g無水MgSO4和1g NaCl，將其加入至離心管中，渦旋混勻1 min，在3500 r/min條件下離心5min。取2 mL的上層提取液加入至含有300 mg無水MgSO4、100 mgPSA及20 mgGCB混合物的10 mL離心管中，渦旋混勻1 min，在3500 r/min條件下離心5 min。取2 mL的提取液在30℃條件下氮吹至近干，用乙腈∶水（v/v，1∶9）溶液定容至1 mL，過0.22 μm濾膜，待測。

2 結果與分析

2.1 UPLC-MS/MS條件的優(yōu)化

首先以超純水作為水相，分別考察乙腈和甲醇作為有機相的分離效果。甲醇作為有機相時，化合物的峰形普遍較寬，且化合物的靈敏度相對乙腈低，因此選用乙腈作為有機相。但在乙腈-純水系統下，烯啶蟲胺與吡蚜酮的色譜峰形較寬且靈敏度較低，而向水中添加0.01%甲酸后色譜峰形得到改善。因此，最終的流動相為乙腈-0.01%甲酸水溶液，同時對洗脫程序進行了優(yōu)化，色譜圖見圖1。

然后以乙腈∶水（v/v，1∶1）溶液稀釋農藥標準品溶液，直接注入質譜中進行質譜條件優(yōu)化。在ESI+模式下，分別采用全掃描和子離子掃描方式優(yōu)化得到各個化合物的母離子、子離子、錐孔電壓以及碰撞能。其中，豐度比較高的子離子作為定量離子，豐度相對較弱的子離子作為定性離子。質譜條件見表1。

圖1 19個化合物的總離子流圖

表1 19種農藥的色譜及質譜條件

2.2 前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化

常規(guī)的QuEChERS方法使用乙腈作為提取溶劑提取樣品中的多種農藥殘留。由于PSA含有堿性基團，會導致部分農藥的回收率降低，因此本文考慮向乙腈中添加少量乙酸以提高回收率。

分別考察了乙腈、含有0.1%乙酸的乙腈、含有1%乙酸的乙腈3種提取溶劑的提取效率，見圖2。當選用乙腈為提取溶劑時，烯啶蟲胺的回收率僅為6.5%，而1%乙酸乙腈為提取溶劑時，烯啶蟲胺和克百威的回收率同樣也不能滿足分析要求，二者回收率分別為36.3%和52.8%。含有0.1%乙酸的乙腈提取待測農藥時，19種農藥的回收率均在82.3%～101.6%，故選用含有0.1%乙酸的乙腈為提取溶劑。

2.2.2 混合鹽的優(yōu)化

實驗考察了3種混合鹽的凈化效果及對回收率的影響，分別為：（1）無水MgSO4+NaCl；（2）無水MgSO4+NH4OAc；（3）無水MgSO4+NaAc。實驗結果見圖3，當使用第3組混合鹽時，丁硫克百威的回收率僅為54.3%；選用第1或第2組混合鹽時，農藥的回收率均滿足分析要求且兩組之間的數值大小并無較大差別，但在實際操作中使用第1組混合鹽時，溶液的分層效果更佳，農藥的回收率在89.8%～101.3%，因此選擇無水硫酸鎂和氯化鈉為混合鹽。

2.2.3 凈化劑的優(yōu)化

根據基質樣品中所含雜質的特點對使用凈化劑的種類進行優(yōu)化，考慮到玫瑰花樣品基質的提取液比較干凈，因此減少了PSA的使用量。比較了每1 mL玫瑰花提取液添加不同質量的PSA時化合物的回收率變化情況。當添加50 mg的PSA時，各個化合物的回收率最高，因此每1 mL的玫瑰花提取液添加50 mg的PSA，見圖4。

由于不能準確判斷玫瑰花中脂肪類物質的含量，考察了玫瑰花提取液是否需要添加C18進行凈化，見圖5。實驗表明，添加C18凈化后各個化合物的回收率相對降低，吡蚜酮的回收率更低至11.2%，凈化液顏色并未出現明顯的變化，因此不添加C18。

圖2 不同提取溶劑的回收率（%，n=5）

圖3 不同混合鹽的回收率（%，n=5）

圖4 不同質量的PSA的回收率（%，n=5）

圖5 不同凈化劑時農藥的回收率（%, n=5）

2.3 基質效應

分別用空白基質提取液和乙腈∶水（v/v，1∶9）溶劑配制農藥的基質校準溶液和標準溶液，以各化合物的峰面積對標準系列濃度繪制基質校準曲線及溶劑標準曲線?；|效應（ME）數值用基質標準曲線的斜率與溶劑標準曲線斜率之比計算，結果見表3。玫瑰花中只有吡蚜酮存在基質增強效應，其他均為基質抑制效應。因此通過基質校準曲線對定量結果進行校正，增加定量結果的準確性。

2.4 定量限與檢出限

用空白基質提取溶液將農藥混合標準儲備液逐級稀釋，制備混合系列標準溶液，以各組分峰面積（y）對濃度（x）繪制標準曲線。在優(yōu)化的實驗條件下，信噪比（S/N）大于10時，各化合物的定量離子對對應的樣品濃度計算定量限（LOQ）；以信噪比（S/N）大于3時，各化合物的定量離子對對應的樣品濃度計算檢出限（LOD）。線性方程、r2、LOQ、LOD見表3，多種農藥在1～100 μg/kg濃度范圍內線性關系良好，LOD在0.023～0.26 μg/kg，LOQ在0.078～0.870μg/kg。

2.5 回收率與精密度

選取不含農藥的玫瑰花樣品，利用1.4優(yōu)化后的方法處理，設定3個不同濃度的添加水平（1、5、10 μg/kg），進行加標回收率實驗，每個水平平行測定5次，計算平均回收率和相對標準偏差（RSD），結果見表4。19種農藥的回收率在77.8%～110.9%，RSDr為1.1%～14.7%，RSDR為2.5%～17.6%。

表3 19種農藥的線性方程、R2、ME、LOD、LOQ

表4 19種農藥的加標回收率和相對標準偏差

2.6 實際樣品測定

在市場購買3份玫瑰花樣品，進行檢測。啶蟲脒在3份樣品中均有檢出，其中1份樣品的啶蟲脒含量為0.39 μg/kg，其余2份的含量低于定量限。除此之外，在另一份樣品中多菌靈和吡蟲啉也有檢出，含量分別為0.17 μg/kg和0.93 μg/kg，其他農藥未有檢出。

3 小結

本研究建立了同時檢測玫瑰花中19種農藥殘留的QuEChERS-UPLC-MS/MS方法。該方法采用0.1%乙酸乙腈提取待測農藥，經無水MgSO4和NaCl混合鹽分離后，以PSA和GCB對提取液進行凈化。實驗對所建立的方法進行方法學考察，包括基質效應、定量限、檢出限、回收率及精密度。結果表明，該方法的回收率在77.8%～110.9%，RSD≤17.6%，符合歐盟檢測標準（回收率在70%～120%，RSD＜20%）。所建立的方法靈敏度高、重現性好，可對待測農藥進行準確的定性定量分析，節(jié)省分析時間，在花類中藥材的農藥殘留分析檢測中有極大的應用發(fā)展空間。