陳琴，曲延英，倪志勇，韓玉慧，程浩然，陳全家

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/ 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830052）

我國(guó)新疆及長(zhǎng)江流域夏秋季節(jié)常晴熱少雨，嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)。為了抵抗干旱（鹽）脅迫，棉花進(jìn)化出了響應(yīng)脅迫的復(fù)雜代謝通路，從而實(shí)現(xiàn)抗（耐）逆反應(yīng)[1-2]，而大部分脅迫應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄激活和抑制是通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的[3]。對(duì)棉花轉(zhuǎn)錄因子的研究有助于揭示棉花應(yīng)對(duì)非生物脅迫的生理和分子機(jī)制[4-5]。

AP2 （Apetala 2）/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族是1 個(gè)龐大的家族，參與了植物細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育以及逆境脅迫等多個(gè)代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)[6-7]。該家族基因首先于1994年在擬南芥中被分離，參與擬南芥花和種子的發(fā)育調(diào)控[8]。隨后在煙草中也發(fā)現(xiàn)了4 個(gè)可以結(jié)合GCC-box 的蛋白，可以受到乙烯的誘導(dǎo)，因此被命名為乙烯反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（Ethylene-responsive element binding proteins，EREBPs），也稱為乙烯響應(yīng)因子（Ethylene response factors，ERF）[9]。在棉花中，Shaheen 等[10]研究表明，GaDREB基因在水分脅迫90 min 后表達(dá)量最高，并能夠與NAC、MYB、AREB、ABRE 和DRE/CRT 相互作用，它們通過(guò)脫落酸途徑參與棉花各種干旱脅迫反應(yīng)。HRD基因是AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因家族的成員。據(jù)Karaba 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，過(guò)表達(dá)擬南芥HRD基因可以增加水稻（Oryza sativa）根的分枝，提高葉片光合同化作用效率，從而通過(guò)增強(qiáng)水稻水分利用率來(lái)提高水稻的抗旱性。Abogadallah 等[12]研究表明，在埃及三葉草（Trifolium alexandrinumL.）中過(guò)表達(dá)HRD基因，可降低三葉草蒸騰速率，保護(hù)光合作用系統(tǒng)，從而增強(qiáng)水分利用率。對(duì)干旱脅迫下轉(zhuǎn)線果芥（Conringia planisiliquaL.）HRD基因煙草與野生型煙草的7 項(xiàng)生理指標(biāo)及形態(tài)、氣孔變化對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草獲得了比野生型煙草更好的抗旱能力[13]。但目前關(guān)于HRD轉(zhuǎn)錄因子基因在棉花抗逆過(guò)程中的生理和分子機(jī)制尚不清楚。因此，本研究利用pET 原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了GhHRD 重組蛋白，并分析了其亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄激活功能，這些研究的開(kāi)展有助于進(jìn)一步闡明GhHRD基因參與棉花抗逆的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本實(shí)驗(yàn)室前期鑒定了8 份陸地棉品種 （系）的抗旱及耐鹽水平，結(jié)果顯示它們綜合抗逆水平排序?yàn)樾玛懼?36 號(hào)＞Y1169 ＞10615-3 ＞ND359-5＞CQJ-5＞KK1543＞新炮1 號(hào)＞新陸早26 號(hào)[14]。因此，選擇新陸中36 號(hào)作為試驗(yàn)材料。

1.2 載體和試劑

pET-28a（＋）、pCAMBIA1304、pGBKT7、BL21（DE3）、EHA105、酵母菌AH109、大腸桿菌DH5α感受態(tài)、pEASY-T1 Simple Cloning Kit 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白胨、酵母提取物、氨芐青霉素購(gòu)自寶信生物科技公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、SalⅠ、NcoⅠ和SpeⅠ、T4DNA 連接酶、YPDA 培養(yǎng)基、SD/-Trp 培養(yǎng)基、SD/-Trp/-His/-Ade 營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；質(zhì)粒DNA 提取試劑盒、瓊脂糖回收試劑盒、Taq酶、dNTP、DNA marker 購(gòu)自天根生化科技有限公司；利福平、異丙基-β-D- 硫代半乳糖苷（IPTG）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；引物合成和測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3 基因的克隆

根據(jù)NCBI 提供的擬南芥HRD基因核苷酸序列（登錄號(hào)：NM_129202.1）設(shè)計(jì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）引物，以新陸中36 號(hào)的cDNA 為模板，以包含開(kāi)放閱讀框的引物（P1：5'-GGATCCATGCATTACTCCAAACCCAA-3'，P2：5'-GTCGACTTAAGGGAATTTCCAGAGGTT-3'，其中下劃線部分依次是BamHⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)） 擴(kuò)增目的基因。PCR 體系為10×TaqBuffer 2.0 μL、2.5 μmol·L－1dNTP 2 μL、TaqDNA 聚合酶0.4 μL、10 μmol·L－1上下游引物各0.4 μL、cDNA 2 μL、dd H2O 補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃5 min，95 ℃40 s，52 ℃40 s，72℃1 min，35 個(gè)循環(huán)后72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)） 瓊脂糖凝膠電泳回收純化后，與pEASY-T1 Simple Cloning Kit 載體連接，鑒定陽(yáng)性克隆，送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析

采用Protscale（http://web.expasy.org/protscale/）推測(cè)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；ExPASy（http://prosite.expasy.org/）分析結(jié)構(gòu)域；用DNAMAN 軟件進(jìn)行蛋白多序列比對(duì)；利用SWISS-MODEL 進(jìn)行蛋白建模 （https://www.swissmodel.expasy.org/）；用Clustal X 和MEGA 5.0 完成多種氨基酸序列比對(duì)及相關(guān)蛋白的同源樹(shù)構(gòu)建。

1.5 原核表達(dá)分析

將陽(yáng)性質(zhì)粒和載體pET-28a(＋)分別用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，連接、轉(zhuǎn)化Escherichia coli/DH5a 感受態(tài)細(xì)胞后測(cè)序。選陽(yáng)性pET-28a(＋)-GhHRD 質(zhì)粒與空載體分別轉(zhuǎn)化E.coli/BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，各挑取單菌落于50 mL 含卡那霉素（100 mg·L－1）的LB 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h。次日取0.05 mL 接菌至5 mL 抗性LB 培養(yǎng)基中，于37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.5，各取1 mL 菌液，12 000 r·min－1離心1 min，收集沉淀為對(duì)照。剩余的菌液進(jìn)行原核表達(dá)體系優(yōu)化：（1）誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化。選定終濃度1 mmol·L－1IPTG、37 ℃誘導(dǎo)，分別在0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、24 h取樣。（2）IPTG 濃度的優(yōu)化。選定時(shí)間4 h、溫度37 ℃，分別用0.01 mmol·L－1、0.05 mmol·L－1、0.1 mmol·L－1、0.5 mmol·L－1、1.0 mmol·L－1和2.0 mmol·L－1IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)。（3）誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化。IPTG 濃度0.05 mmol·L－1，時(shí)間4 h，分別在25℃、30 ℃、37 ℃條件下誘導(dǎo)。收集的每管菌沉淀加入1 mL 1×十二烷基硫酸鈉（SDS）凝膠上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min，進(jìn)行SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電泳，并通過(guò)濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯膜（PVDF）上進(jìn)行Western Blotting 分析。

1.6 亞細(xì)胞定位分析

設(shè)計(jì)帶有NcoⅠ和SpeⅠ位點(diǎn)的引物（P3：5'-CCATGGATGCATTACTCCAAACCCAA-3'，P4：5'-ACTAGTTTAAGGGAATTTCCAGAGGTTAT-3'），將GhHRD基因插入pCAMBIA1304 載體35S 啟動(dòng)子和GFP之間，構(gòu)建pCAMBIA1304-GhHRD-GFP 瞬時(shí)表達(dá)載體。采用凍融法將載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105 菌株。將該菌株活化OD600為0.5，5 000 r·min－1離心10 min 棄上清液，用含有10 mmoL·L－1MgCl2和100 μmol·L－1乙酰丁香酮的MS 液體培養(yǎng)基重懸菌體細(xì)胞。將預(yù)培養(yǎng)后的第5 層洋蔥表皮放入重懸液中浸泡30 min，再轉(zhuǎn)入含有100 μmol·L－1AS 的MS 固體培養(yǎng)基中，25 ℃暗培養(yǎng)28 h，在正置熒光顯微鏡下觀察GFP 信號(hào)，確定其亞細(xì)胞定位。以pCAMBIA1304-GFP 為對(duì)照。

1.7 轉(zhuǎn)錄激活功能驗(yàn)證分析

用帶有NcoⅠ和SalⅠ位點(diǎn)的引物 （上游：P3、 下游：P2），將GhHRD基因片段插入pGBKT7 載體，并轉(zhuǎn)化酵母AH109 細(xì)胞。將帶有pGBKT7 對(duì)照載體及鑒定為陽(yáng)性的 pGBKT7-GhHRD 載體的酵母菌活化，分別涂布在SD/-Trp 營(yíng)養(yǎng)單缺型培養(yǎng)基和SD/-Trp/-His/-Ade營(yíng)養(yǎng)缺陷型（三缺）培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d 后，觀察酵母生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhHRD 基因的克隆與分析

以新陸中36 號(hào)的cDNA 為模板，利用反轉(zhuǎn)錄-PCR 得1 條開(kāi)放閱讀框?yàn)?55 bp 的核酸序列（圖1）。經(jīng)在線軟件ExPASy 分析，該序列編碼184 個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為5，相對(duì)分子質(zhì)量約為19.539 kDa。位于第27～84 氨基酸處有1 個(gè)AP2-ERF 功能結(jié)構(gòu)域（圖2A），三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白由3 個(gè)β- 折疊、3 個(gè)α- 螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成（圖2B）。

圖1 GhHRD基因RT-PCR電泳圖Fig.1 RT-PCR products of GhHRD gene

圖2 GhHRD基因結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Bioinformatics analysis results of GhHRD

經(jīng)Blast 比對(duì)，篩選出9 條與GhHRD 相似性較高的蛋白序列，DNAMAN 多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)各物種HRD 蛋白的AP2-ERF 結(jié)構(gòu)域 （圖3 紅框） 序列高度保守，GhHRD 蛋白AP2-ERF 結(jié)構(gòu)域的第14 位為纈氨酸，第19 位為谷氨酸（圖3箭頭）。

圖3 GhHRD蛋白與其他物種HRD蛋白多序列比對(duì)Fig.3 Multiple sequence alignment of GhHRD and HRD proteins from other plant

用MEGA5.0 軟件鄰近連接法（Neighbor-Joining，NJ） 對(duì)陸地棉 （Gossypium hirsutumL.）、亞洲棉（G.arboreumL.）、雷蒙德氏棉（G.raimondiiL.）、榴蓮（Durio zibethinus）、黃麻（Corchorus capsularisL.）、可可（Theobroma cacaoL.）、埃及錦葵（Corchorus olitoriusL.）、橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis）、 木薯（Manihot esculenta）、 擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的HRD 蛋白序列構(gòu)建生物系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。圖4 結(jié)果顯示，GhHRD 與亞洲棉、雷蒙德氏棉中HRD 蛋白的親緣關(guān)系最近。

圖4 HRD蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of HRD

2.2 GhHRD蛋白原核表達(dá)分析

用引物P1、P2 將GhHRD插入到原核表達(dá)載體pET-28a（＋），重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定后，瓊脂糖凝膠電泳顯示酶切小片段為555 bp 左右（圖5），且測(cè)序結(jié)果與目的序列完全一致，表明pET-28a（＋）-GhHRD 原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

用構(gòu)建好的重組質(zhì)粒與pET-28a（＋）空載體分別轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)重組工程菌BL21/pET-28a（＋）-GhHRD 進(jìn)行IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，以BL21/pET-28a（＋）為陰性對(duì)照。如圖6，電泳結(jié)果顯示，在20 kDa～26 kDa 之間有特異條帶，由于重組蛋白His 標(biāo)簽蛋白及相關(guān)序列大小約4.8 kDa，因此所表達(dá)的蛋白條帶大小與GhHRD 預(yù)測(cè)的19.539 kDa 基本吻合，說(shuō)明該重組工程菌可以按試驗(yàn)設(shè)計(jì)正確表達(dá)目的蛋白。經(jīng)誘導(dǎo)條件優(yōu)化試驗(yàn)，最終發(fā)現(xiàn)在25 ℃，0.05 mmol·L－1IPTG 誘導(dǎo)4 h 最佳。將誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行Western 印跡分析，在約24 kDa 處出現(xiàn)特異性抗原- 抗體結(jié)合帶，進(jìn)一步說(shuō)明GhHRD 重組蛋白能夠表達(dá)。

圖5 原核表達(dá)載體pET-28a（＋）-GhHRD雙酶切鑒定Fig.5 Identification of recombinant plasmid by double enzyme digestion

圖6 GhHRD重組蛋白原核表達(dá)及Western blotting鑒定Fig.6 Prokaryotic expression and Western blotting analysis of recombinant GhHRD protein

2.3 亞細(xì)胞定位分析

用引物P3、P4 構(gòu)建pCAMBIA1304-GhHRDGFP 瞬時(shí)表達(dá)載體，雙酶切和測(cè)序結(jié)果顯示載體構(gòu)建成功。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，GhHRD-GFP 融合蛋白熒光信號(hào)主要集中于細(xì)胞核（圖7），該結(jié)果驗(yàn)證了生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)結(jié)果，GhHRD 是1個(gè)核蛋白。

圖7 GhHRD在洋蔥表皮中的定位Fig.7 Subcellular localization of GhHRD fusion protein in onion epidermal cells

2.4 轉(zhuǎn)錄激活功能驗(yàn)證分析

GhHRD為轉(zhuǎn)錄因子基因，為驗(yàn)證其是否具有轉(zhuǎn)錄激活作用，以pGBKT7 載體為陰性對(duì)照，將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化AH109 酵母感受態(tài)細(xì)胞。如圖8所示，二者在酵母單缺培養(yǎng)基SD/-Trp 中生長(zhǎng)狀態(tài)一致，而在三缺培養(yǎng)基SD/-Trp/-His/-Ade 上，轉(zhuǎn)入pGBKT7-GhHRD 的酵母菌株可以正常生長(zhǎng)，陰性對(duì)照無(wú)法生長(zhǎng)。說(shuō)明效應(yīng)基因都能夠正常表達(dá)，激活了下游的報(bào)告基因，使其能夠在His 和Ade 缺陷培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)。這說(shuō)明，GhHRD 融合蛋白對(duì)酵母菌株無(wú)毒性，GhHRD基因具備轉(zhuǎn)錄自激活功能，驗(yàn)證了GhHRD 是轉(zhuǎn)錄因子。

圖8 GhHRD轉(zhuǎn)錄激活活性分析Fig.8 Transcriptional activation analysis of GhHRD

3 討論

AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族含有1 個(gè)由60～70個(gè)氨基酸組成的保守的AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域。依據(jù)結(jié)構(gòu)域的數(shù)量，AP2/ERF 家族可以分為4 個(gè)亞族，分別是含2 個(gè)結(jié)構(gòu)域的AP2 亞族、1 個(gè)結(jié)構(gòu)域的干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（Dehydration-responsive element-binding protein，DREB） 亞族和ERF亞族、1 個(gè)結(jié)構(gòu)域和1 個(gè)B3 結(jié)構(gòu)域的RAV（Related to ABI3/VP1）亞族，其中DREB 亞族在保守域的第14 位都具有保守的纈氨酸 （V14），在第19 位都有谷氨酸（E19），而ERF 亞族在第14 位為丙氨酸（A14），第19 位為天冬氨酸（D19），但也有例外[15]。本試驗(yàn)克隆的GhHRD基因編碼產(chǎn)物含有1 個(gè)AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域且在第14 位為纈氨酸，第19 位為谷氨酸，因此GhHRD 屬于AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族的DREB 亞組。

干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（DREB）能夠?qū)Ｒ恍宰R(shí)別順式作用元件DRE （Dehydration responsive element）/CRT（C-repeat），主要在干旱和冷誘導(dǎo)的響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮作用[16]。研究發(fā)現(xiàn)，在低溫和干旱脅迫的試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)DREB1 基因的擬南芥植株生長(zhǎng)良好，而對(duì)照組全部死亡[17]。Liu 等[18]發(fā)現(xiàn)桑樹(shù)DREB4a基因在干旱、NaCl、 低溫和高熱處理后表達(dá)增高，過(guò)表達(dá)DREB4a基因的煙草根長(zhǎng)和株高明顯高于野生型，且具有更強(qiáng)的耐旱性和耐鹽性。Huang 等[19-21]在棉花中克隆了GhDBP2、GhDBP3 基因和GhDREB1L基因，RT-PCR 顯示該基因在低溫、 干旱和鹽脅迫下高效表達(dá)。Liu等[22]對(duì)棉花轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，在雷蒙德氏棉中共鑒定出269 個(gè)AP2/ERF 類轉(zhuǎn)錄因子基因，在陸地棉TM-1 中鑒定出504 個(gè)，其中151 個(gè)非重復(fù)的DREB 和ERF 亞家族基因?qū)Σ煌{迫有反應(yīng)：132 個(gè)基因受寒冷誘導(dǎo)，63 個(gè)基因受干旱誘導(dǎo)，94 個(gè)基因受熱誘導(dǎo)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 證實(shí)13 個(gè)GhDREB和15 個(gè)GhERF基因受冷和/ 或干旱誘導(dǎo)。可見(jiàn)，DREB 類轉(zhuǎn)錄因子基因在植物抗逆過(guò)程中扮演重要角色，由此推測(cè)GhHRD基因可能在棉花逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)中扮演重要角色。但目前關(guān)于棉花DREB 類轉(zhuǎn)錄因子基因GhHRD的克隆和功能驗(yàn)證還未見(jiàn)報(bào)道。

4 結(jié)論

本研究從陸地棉中克隆了1 個(gè)AP2/ERF 家族DREB 類轉(zhuǎn)錄因子基因GhHRD，能夠經(jīng)原核表達(dá)載體正確誘導(dǎo)表達(dá)。該基因編碼產(chǎn)物定位于細(xì)胞核且具有明顯轉(zhuǎn)錄自激活功能。通過(guò)生物信息學(xué)分析推測(cè)該基因可能參與了棉花逆境脅迫應(yīng)答過(guò)程，但它在棉花逆境脅迫中的作用及其機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。