王俊娟，陸許可，陰祖軍，王德龍，王帥，穆敏，陳修貴，郭麗雪，樊偉麗，陳超，葉武威

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/ 棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽(yáng)455000）

干旱、低溫和高鹽分等非生物脅迫嚴(yán)重影響作物生長(zhǎng)發(fā)育，是造成世界范圍內(nèi)作物減產(chǎn)的主要因素[1]。這些非生物脅迫也是制約棉花生產(chǎn)的主要逆境因子。植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，形成了各種不同的適應(yīng)性生理生化機(jī)制，在遭遇逆境脅迫時(shí)細(xì)胞內(nèi)會(huì)發(fā)生一系的生理、生化以及基因表達(dá)的變化[2]，會(huì)產(chǎn)生一系列具有保護(hù)功能的蛋白來(lái)維持其正常代謝活動(dòng)。挖掘與棉花非生物逆境脅迫相關(guān)的功能基因，對(duì)開(kāi)展棉花抗逆分子育種具有重要意義。

胚胎發(fā)育后期豐富蛋白（Late embryogenesis abundant proteins，LEA 蛋白） 是1 類重要的植物細(xì)胞脫水保護(hù)蛋白[3-4]，是1 種水溶性蛋白，最早在棉花中被發(fā)現(xiàn)[5-6]，1986年首次被Galau 等[7]命名。根據(jù)LEA 蛋白保守結(jié)構(gòu)域可以將其分為不同的家族，其中第3 組LEA 蛋白家族（LEA3）具有多拷貝11 個(gè)氨基酸（TAQAAKEKAGE）重復(fù)基元序列特征[8]。LEA3 蛋白通過(guò)這11 個(gè)氨基酸殘基序列形成的兩性α- 螺旋與其他蛋白質(zhì)或細(xì)胞膜結(jié)合，從而保護(hù)蛋白或細(xì)胞膜的活性，減緩逆境脅迫對(duì)細(xì)胞的傷害[9]；還可以作為分子伴侶阻止因水分脅迫導(dǎo)致的蛋白間的變性聚集[10]。同時(shí)，低溫、干旱和高鹽分等非生物脅迫均可以顯著誘導(dǎo)LEA3 蛋白的積累。近年來(lái)，對(duì)LEA3 在多種植物中的功能已有大量報(bào)道：在干旱脅迫條件下，LEA3 可以保護(hù)乳酸脫氫酶的活性[11]；在缺少LEA3 蛋白的情況下，小麥根系受到干旱脅迫傷害后無(wú)法恢復(fù)正常[12]；在耐鹽性較強(qiáng)的印度水稻中LEA3 蛋白的積累量顯著高于鹽敏感型植株[13]；小麥與黑麥中葉綠體中LEA3 蛋白的積累可以明顯提高植株抗冷性[14]。轉(zhuǎn)基因研究表明，在水稻中過(guò)量表達(dá)大麥的LEA3 蛋白（HVA1）可以顯著提高其耐鹽性和抗旱性[15]；在酵母中過(guò)量表達(dá)小麥TaLEA3 等基因可提高酵母耐高滲透脅迫、耐鹽和抗凍能力[16]；等等。但有關(guān)LEA3 在棉花抗冷中的作用報(bào)道相對(duì)較少。因此，本研究擬克隆棉花GhLEA3 基因，并分析其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特性，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析；檢測(cè)其在受低溫脅迫前后葉片中的表達(dá)量；構(gòu)建植物表達(dá)載體，進(jìn)行亞細(xì)胞定位，并對(duì)轉(zhuǎn)GhLEA3 基因擬南芥后代的抗冷性進(jìn)行研究，預(yù)測(cè)其在抗冷性中的可能功能。

1 材料與方法

1.1 陸地棉試驗(yàn)材料及其培養(yǎng)和逆境處理

本試驗(yàn)所用棉花材料為陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所抗逆鑒定課題提供。2017年5 月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所抗逆鑒定實(shí)驗(yàn)室恒溫光照生長(zhǎng)箱中進(jìn)行育苗，采用沙培法育苗（28 ℃，光照14 h、黑暗10 h），正常水分條件（沙土相對(duì)含水量約為23.00%）下進(jìn)行棉花的培養(yǎng)。

1.2 擬南芥試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用擬南芥野生型（Col-0 生態(tài)型）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所棉花抗逆鑒定課題保存。

1.3 棉花RNA的提取和GhLEA3基因克隆

利用北京艾德萊生物科技有限公司生產(chǎn)的EASYspinPlus 植物RNA 快速提取試劑盒對(duì)以上所取材料進(jìn)行RNA 提取，利用Nanodrop2000 核酸分析儀測(cè)定總RNA 的濃度和純度，同時(shí)用10 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的完整性。利用PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa，China）將RNA反轉(zhuǎn)錄合成第1 鏈cDNA，以反轉(zhuǎn)錄獲得的棉花cDNA 為模板，利用Primer Premier5.0 軟件設(shè)計(jì)特異引物，上游引物為GhLEA3-F：5′-ATGGCGACAAGGCAAGAGAA-3′，下游引物為GhLEA3-R：5′-TCACAGATTGGTTTTGTCCGA-3′，擴(kuò)增GhLEA3 全長(zhǎng)cDNA 序列。將目的基因與載體連接、 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)以及進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction,PCR），并且測(cè)序驗(yàn)證。所用的PCR 程序、 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)和純化均參考王俊娟等[17]的方法。測(cè)序由蘇州金唯智科技有限公司北京分公司完成，其他試驗(yàn)均在棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.4 棉花GhLEA3基因的生物信息學(xué)分析

1.4.1棉花GhLEA3 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、相對(duì)分子質(zhì)量、磷酸化位點(diǎn)分析和功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)。利用在線蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）、InterPro（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）對(duì)GhLEA3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用Protparam（http://web.expasy.org/protparam/） 分析蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)；利用ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/）預(yù)測(cè)親疏水性，利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用NetPhos2.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/） 程序預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)。

1.4.2棉花GhLEA3 與其他幾個(gè)物種LEA3 的進(jìn)化樹(shù)分析。在NCBI 上查找胡蘿卜（Daucus carota，P20075.1，DcLEA3），野生大豆（Glycine soja，A0A0B2SLH4，GsLEA3），葡萄 （Vitis vinifera，XP_002284002.1，VvLEA3），小麥（Triticum aestivum，AAA34267.1，TaLEA3），歐洲白樺（Betula pendula，CAA79329.1，BpLEA3），腎豆（Phaseolus vulgaris，ABA26579.1，PvLEA3），擬南芥（Arabidopsis thaliana，AAD20140.1，AtLEA3），大豆（Glycine max，AAD01431.1，GmLEA3），毛檉柳（Tamarix hispida，AHJ78644.1，ThLEA3），可可（Theobroma cacao，EOY08068.1，TcLEA3）10 個(gè)物種的LEA3 蛋白序列，括號(hào)里依次為物種的拉丁文、該物種LEA3 蛋白的GenBank 登錄號(hào)以及本研究對(duì)各物種LEA3 的統(tǒng)一命名。其中AtLEA3 是擬南芥中具有LEA3 典型結(jié)構(gòu)，且在抗逆中起作用的1 個(gè)成員。

利用軟件MEGA6.06 對(duì)棉花GhLEA3 和前述10 個(gè)物種的LEA3 蛋白質(zhì)序列進(jìn)行聚類分析，使用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建、繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 GhLEA3亞細(xì)胞定位分析

利用網(wǎng)站（http://bioinfo.clontech.com/infusion）在線設(shè)計(jì)In-Fusion 引物（上游引物為InGh-LEA3-F：5'-CACGGGGGACTCTAGAATGGCGACAAGGCAAGAGAA-3'，下游引物為InGhLEA3-R：5'-AGGGACTGACCACCCGGGTCACAGATTGGTTTTGTCCGA-3'，下劃線標(biāo)識(shí)酶切位點(diǎn)），以pBI121-GhLEA3 質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增。選擇限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和SmaⅠ對(duì)植物表達(dá)載體pBI121-GFP 進(jìn)行雙酶切，采用In-Fusion 連接技術(shù)構(gòu)建融合蛋白瞬時(shí)表達(dá)載體35S ∷Gh-LEA3-GFP，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，同時(shí)選用限制性內(nèi)切酶BglⅡ和EcoRⅠ驗(yàn)證插入位點(diǎn)后提取質(zhì)粒。選用這2 個(gè)酶是因?yàn)锽glⅡ酶切位點(diǎn)在目標(biāo)基因Gh-LEA3 上沒(méi)有，而在表達(dá)載體上有，而EcoRⅠ酶切位點(diǎn)在表達(dá)載體上沒(méi)有，而在目標(biāo)基因上有。亞細(xì)胞定位分析參考趙小潔等[18]的方法。

1.6 三葉期棉花幼苗低溫脅迫后GhLEA3的實(shí)時(shí)熒光定量分析

在三葉期對(duì)棉苗進(jìn)行4 ℃處理（24 h），以仍在28 ℃條件下正常培育為對(duì)照（CK）。取倒一葉（3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)），剪碎，放入液氮中速凍，－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用Primer Premier5.0 設(shè)計(jì)GhLEA3 的熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （Real time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）引物（上游引物GhLEA3-F：5'-TGGAATTGGGTTTGGAGCCG-3'，下游引物GhLEA3-R：5'-TCGCATGGTAATCGCCTCAC-3'），以Gossypium hirsutum Histone3（Accession No.：AF024716） 作為內(nèi)參基因進(jìn)行qPCR。PCR 程序：94 ℃30 s；94 ℃5 s，55 ℃34 s，72 ℃34 s，共40 個(gè)循環(huán)。所用儀器為ABI 7500 Real Time PCR System（ABI，美國(guó)）。qPCR 結(jié)果分析參考Afrin 等[19]報(bào)道的2－ΔΔCt方法。每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)、3 個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.7 轉(zhuǎn)GhLEA3基因擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化、檢測(cè)和抗逆性分析

遺傳轉(zhuǎn)化及后代檢測(cè)：采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法[20]，用外源基因表達(dá)載體35S∷GhLEA3-GFP 轉(zhuǎn)化擬南芥野生型，利用含有卡那霉素的1/2 MS 培養(yǎng)基種植篩選轉(zhuǎn)基因種子；按張?zhí)毂猍21]方法進(jìn)行培養(yǎng)和繁殖，對(duì)獲得的T3擬南芥種子按單株收獲，種植，采用CTAB 法[22]提取轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥葉片的DNA。

利用Primer Premier5.0 軟件，在35S 啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)上游引物（35S-F：5'-CCGGAAACCTCCTCGGATTC-3'），利用GhLEA3 基因設(shè)計(jì)下游引物（GhLEA3-R：5'-TGGTTTTGTCCGATCGATCA-3'），以野生型擬南芥（WT）作為陰性對(duì)照，含有GhLEA3 基因片段的質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)利用擬南基因Atactin2 為內(nèi)標(biāo)基因（上游引物Atactin2-F：5'-TTCCTCATGCCATCCTCCGTCTT-3'，下游引物Atactin2-R：5'-CAGCGATACCTGAGAACATAGTGG-3'） 對(duì)轉(zhuǎn)GhLEA3 基因擬南芥T3和野生型擬南芥葉片所提取的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。所用程序?yàn)?4 ℃，5 min；94 ℃45 s，58℃45 s，72 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。利用10 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶并照相。

低溫萌發(fā)試驗(yàn)：將轉(zhuǎn)GhLEA3 基因擬南芥T3種子和野生型（WT）在25 ℃（CK）常溫條件下和4 ℃低溫條件下分別進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)。參考張?zhí)毂猍21]方法進(jìn)行，將T3種子和WT 種子分別均勻點(diǎn)播于同一培養(yǎng)皿上，每板各播50 粒T3種子和WT 種子，共播6 板，其中3 板放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作為對(duì)照處理，另外3 板放入4 ℃冰箱中作為低溫處理，20 d 后調(diào)查萌發(fā)數(shù)，以擬南芥種子發(fā)白為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算萌發(fā)率。

轉(zhuǎn)基因擬南芥苗期葉片細(xì)胞膜透性測(cè)定：擬南芥苗移栽后在20 ℃條件下正常培養(yǎng)14 d，此時(shí)尚未抽薹。對(duì)其進(jìn)行低溫處理：4 ℃處理24 h，并以處理0 h （仍為20 ℃條件培養(yǎng)） 為對(duì)照（CK），取全部葉片，剪碎，每重復(fù)稱2 g 左右，3個(gè)重復(fù)，放到5 mL 離心管中，加入2 mL 去離子水，混勻，測(cè)其電導(dǎo)率，具體測(cè)定方法參考王俊娟等[23]的方法。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用MS Excel 2003 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖；利用Stata 11.0 軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhLEA3 基因克隆

在前期的陸地棉低溫轉(zhuǎn)錄組試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)1個(gè)功能注釋為L(zhǎng)EA3 蛋白的基因受4 ℃低溫脅迫后在棉花葉片中上調(diào)表達(dá)，推測(cè)其與棉花的抗冷性有一定的相關(guān)性。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[24-25]，在NCBI中搜索已知的擬南芥 （AAD20140.1）、 胡蘿卜（P20075.1）的LEA3 蛋白質(zhì)序列，在棉花基因組計(jì)劃（Cotton Genome Project，CGP）網(wǎng)站（http://cgp.genomics.org.cn/page/species/index.jsp） 進(jìn)行blastp 比對(duì)，搜索到相似的蛋白序列，同時(shí)查找其對(duì)應(yīng)的編碼序列，設(shè)計(jì)引物，以棉花TM-1 葉片的cDNA 為模板，擴(kuò)增出完整的編碼序列（圖1），得到的閱讀框長(zhǎng)度為1 218 bp，測(cè)序結(jié)果正確。

圖1 GhLEA3在陸地棉中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Products of PCR amplification of GhLEA3 gene from Gossypium hirsutum L.

2.2 棉花GhLEA3蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、相對(duì)分子質(zhì)量及二級(jí)結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)和功能結(jié)構(gòu)域分析

GhLEA3 蛋白質(zhì)包含405 個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量為44.5 kDa，等電點(diǎn)5.88。對(duì)其序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GhLEA3 蛋白中富含丙氨酸（15.8%）、賴氨酸（13.8%）和谷氨酸（12.1%），含少量色氨酸和異亮氨酸（0.5%），不含半胱氨酸、吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸（圖2A）；蛋白呈酸性，帶負(fù)帶荷，帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)（Asp＋Glu）為84個(gè)，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg＋Lys）為79 個(gè)；預(yù)測(cè)半衰期約為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為29.37，為穩(wěn)定蛋白。蛋白的親疏水性分析發(fā)現(xiàn)，蛋白中親水性氨基酸明顯多于疏水性氨基酸（圖2B），親水性平均系數(shù)為－1.302，屬親水性蛋白。SOPMA 分析結(jié)果（圖2C）表明：GhLEA3 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)α螺旋 （Alpha helix） 包含286 個(gè)氨基酸殘基，占70.62%，組成該蛋白的主體結(jié)構(gòu)；無(wú)規(guī)則卷曲（Random coil） 的氨基酸殘基有86 個(gè)，占21.23%；延伸鏈（Extended strand）包含17 個(gè)氨基酸殘基，占4.27%；β- 轉(zhuǎn)角（Beta turn）包含16 個(gè)氨基酸殘基，占3.95%。推測(cè)該蛋白的功能結(jié)構(gòu)域主要由α 螺旋構(gòu)成。

圖2 GhLEA3蛋白結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Protein structure analysis of GhLEA3 protein

SMART 和InterPro 分析表明，該氨基酸序列含有5 個(gè)功能結(jié)構(gòu)域PF02987（LEA_4），分別位于第111 ～152、143 ～184、165 ～201、198 ～241、271～314 個(gè)氨基酸，表明該蛋白擁有LEA家族中第3 組成員的典型結(jié)構(gòu)[26-27]，屬于LEA3類蛋白，命名為GhLEA3。

2.3 棉花GhLEA3蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

GhLEA3 基因所編碼蛋白共含有83 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中含有36 個(gè)絲氨酸（Serine）磷酸化位點(diǎn)、31 個(gè)蘇氨酸 （Threonine） 磷酸化位點(diǎn)、16個(gè)酪氨酸（Tyrosine）磷酸化位點(diǎn)（圖3）。由此推測(cè)，GhGLEA3 蛋白的活性與其磷酸化調(diào)控關(guān)系密切。

圖3 棉花GhLEA3蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.3 Protein phosphorylation sites prediction of GhLEA3 protein

2.4 棉花GhLEA3蛋白與其他植物L(fēng)EA3蛋白的進(jìn)化關(guān)系分析

對(duì)棉花GhLEA3 基因編碼的蛋白序列與其他物種LEA3 蛋白序列的進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果（圖4）表明，11 個(gè)LEA3 蛋白質(zhì)被分為2 類，小麥和腎豆LEA3 蛋白單獨(dú)聚為一類，其余9 個(gè)物種聚為第二類。第二類又可分為2 個(gè)亞類：棉花與擬南芥LEA 遺傳距離最近，同時(shí)與大豆、可可、歐洲白樺、胡蘿卜、葡萄LEA3 遺傳距離亦較近，為一個(gè)亞類；野生大豆、毛檉柳與棉花LEA3 遺傳距離比較遠(yuǎn)，聚為另一個(gè)亞類。進(jìn)一步分析表明，GhLEA3 與AtLEA3 的氨基酸序列相似性為52.6%，一致性為41.6%。

2.5 35S∷GhLEA3-GFP熒光表達(dá)載體的酶切驗(yàn)證和亞細(xì)胞定位分析

挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，目標(biāo)序列比對(duì)結(jié)果正確。表達(dá)載體酶切驗(yàn)證結(jié)果（圖5）表明，表達(dá)載體構(gòu)建成功，將其命名為35S∷GhLEA3-GFP。

圖4 棉花GhLEA3蛋白與10個(gè)植物L(fēng)EA3蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of GhLEA3 protein and 10 LEA3 proteins of other plants

圖5 35S∷GhLEA3-GFP表達(dá)載體酶切驗(yàn)證Fig.5 Enzyme digestion of expression vector 35S∷GhLEA3-GFP

通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)GhLEA3 蛋白的亞細(xì)胞定位顯示，對(duì)照pBI121-GFP 的綠色熒光分布在整個(gè)細(xì)胞中 （圖6A ～C），而35S ∷Gh-LEA3-GFP 融合蛋白的綠色熒光信號(hào)大多分布在液泡和小泡里（圖6D～F），推測(cè)GhLEA3 蛋白可能在液泡和小泡里發(fā)揮作用。這也說(shuō)明該基因能夠正常表達(dá)，為下一步使用基因槍活體轉(zhuǎn)化擬南芥和棉花材料提供了理論依據(jù)。

2.6 低溫脅迫條件下GhLEA3基因在三葉期棉苗葉片中的表達(dá)

qPCR 分析結(jié)果（圖7）表明，與CK（28 ℃培養(yǎng)）相比，4 ℃低溫脅迫處理24 h 后，GhLEA3 基因在三葉期棉苗葉片中的表達(dá)水平提高近10倍，說(shuō)明GhLEA3 基因在棉苗葉片響應(yīng)低溫脅迫過(guò)程中起正調(diào)控作用。

2.7 轉(zhuǎn)GhLEA3基因擬南芥的抗卡那霉素篩選與分子檢測(cè)結(jié)果

圖6 棉花GhLEA3蛋白的亞細(xì)胞定位Fig.6 Sub-cellular localization of GhLEA3 protein

圖7 低溫脅迫條件下GhLEA3基因在三葉期棉苗葉片中實(shí)時(shí)熒光定量分析Fig.7 Expression of GhLEA3 gene in cotton leaf at the three-leaves stage under low temperature stress treatment by qPCR method

對(duì)收獲的20 個(gè)轉(zhuǎn)GhLEA3 基因擬南芥T1陽(yáng)性植株后代分別進(jìn)行抗卡那霉素篩選，至T2時(shí)黃化苗（野生型）已占很小比例，到T3時(shí)已無(wú)黃化苗，表明得到了純合的T3陽(yáng)性植株（圖8），可以利用它們進(jìn)行下一步的分子檢測(cè)和抗逆性試驗(yàn)。

對(duì)轉(zhuǎn)GhLEA3 基因的擬南芥T3植株、 野生型擬南芥、pBI121-GhLEA3 質(zhì)粒等進(jìn)行擴(kuò)增并檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株T3-1、T3-2、T3-3、T3-9 和T3-11有明顯的大約1 218 bp 的特異條帶，在單株T3-7中該條帶稍弱，但也顯示正常，與陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒中擴(kuò)增出的目標(biāo)條帶大小一致，在陰性對(duì)照野生型擬南芥植株中則無(wú)條帶（圖9），表明獲得了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)GhLEA3 基因的陽(yáng)性擬南芥植株。該結(jié)果證明抗卡那霉素篩選結(jié)果是可靠的。

2.8 轉(zhuǎn)GhLEA3基因擬南芥T3種子在低溫條件下的萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果

在正常溫度（25 ℃）下，轉(zhuǎn)GhLEA3 基因擬南芥T3與野生型（WT）種子發(fā)芽率均達(dá)100%，沒(méi)有差異。4 ℃處理20 d 后轉(zhuǎn)GhLEA3 基因擬南芥T3種子的發(fā)芽率為95.92%，顯著高于野生型的（78.31%），說(shuō)明轉(zhuǎn)GhLEA3 基因提高了擬南芥種子在低溫條件下的萌發(fā)能力。

圖8 卡那霉素對(duì)轉(zhuǎn)GhLEA3基因擬南芥的有效篩選Fig.8 Effective screening of transgenic Arabidopsis thaliana by GhLEA3 gene in kanamycin culture medium

圖9 轉(zhuǎn)GhLEA3基因擬南芥T3植株的PCR檢測(cè)Fig.9 PCR production detection of transgenic Arabidopsis T3 plants with GhLEA3 gene

2.9 轉(zhuǎn)GhLEA3基因擬南芥T3苗期葉片細(xì)胞膜透性

電導(dǎo)率測(cè)定結(jié)果（圖10）表明，野生型擬南芥（WT）葉片受低溫脅迫后，電導(dǎo)率比CK（20 ℃培養(yǎng)）極顯著上升，說(shuō)明其葉片受低溫脅迫后細(xì)胞膜破裂，電解質(zhì)大量滲漏；而轉(zhuǎn)GhLEA3 基因擬南芥T3葉片電導(dǎo)率與CK 差異不顯著，說(shuō)明其細(xì)胞膜在低溫脅迫時(shí)受到了保護(hù)。由此推測(cè)，Gh-LEA3 蛋白在低溫脅迫條件下可能對(duì)葉片細(xì)胞膜起保護(hù)作用。

圖10 轉(zhuǎn)GhLEA3基因擬南芥T3和野生型葉片的電導(dǎo)率對(duì)比Fig.10 The conductivity rate of leaves from transgenic Arabidopsis thaliana T3 plants with GhLEA3 gene and its wild type

3 討論

GhLEA3 蛋白中富含丙氨酸、賴氨酸和谷氨酸（12.1%），色氨酸和異亮氨酸含量較少（0.5%），不含半胱氨酸，這與LEA3 蛋白由高度親水性氨基酸組成、富含賴氨酸和甘氨酸，缺乏半胱氨酸和酪氨酸的特征相似[28]，這種親水性使LEA3 蛋白可能保持細(xì)胞水分和防止其他蛋白凝聚或脫水[29]。但GhLEA3 蛋白中甘氨酸含量較少，很可能是物種間差異造成的。也可能正是LEA3 基因家族編碼產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的多樣性，造成了LEA3 基因家族功能的多樣性。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，GhLEA3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α- 螺旋組成，高比例的α- 螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)保障蛋白具有高度的柔性和流動(dòng)性，可以在逆境條件下進(jìn)行結(jié)構(gòu)變異[9]，從而保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，特別是嚴(yán)重脫水或冰凍時(shí)使膜系統(tǒng)免遭傷害，推測(cè)正是GhLEA3 蛋白的這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為其在低溫條件下提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的萌發(fā)能力和葉片抗冷性奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

不同植物中LEA3 蛋白的亞細(xì)胞定位不同，如小麥中LEA3 定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核[16]；擬南芥中的LEA3 蛋白COR15A 被定位于葉片的葉綠體基質(zhì)中[30]；禾本科作物如黑麥、小麥、大麥中的類似LEA3 蛋白含有分類信號(hào)，使其易于定位葉綠體或線粒體中[14]；桑樹(shù)的LEA3 蛋白WAP27位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[31]，玉米的ZmLEA3 蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中發(fā)揮作用[32]；胡蘿卜中LEA3 蛋白DC8位于成熟種子的內(nèi)膜系統(tǒng)、 細(xì)胞壁和液泡中[25]。LEA3 不同的亞細(xì)胞定位為L(zhǎng)EA3 蛋白功能的多樣性提供了有力的證據(jù)。在本試驗(yàn)中，亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，GhLEA3 蛋白定位于液泡和小泡中，這與大麥的LEA3（HVA1）[33]、胡蘿卜LEA3蛋白DC8 定位相似[25]。Marttila 等[33]研究表明HVA1 定位在細(xì)胞質(zhì)和液泡中，且HVA1 蛋白不能被糖基化，所以有可能利用1 種可變的、非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)依賴的液泡途徑，促使液泡中的離子重新分配以阻止蛋白在脅迫條件下沉降；同時(shí)，冷處理或干旱脅迫能顯著增加發(fā)芽的大麥種子中HVA1 基因的表達(dá)。由此推測(cè)GhLEA3 蛋白在液泡中積累也有類似的功能，需要進(jìn)一步挖掘驗(yàn)證。雖然胡蘿卜中LEA3 蛋白DC8 的N 段沒(méi)有明顯的疏水結(jié)構(gòu)，但試驗(yàn)證明DC8 蛋白通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)- 高爾基體途徑運(yùn)輸，隨后沉積在液泡或細(xì)胞壁中[25]。推測(cè)GhLEA3 蛋白有可能與大麥的HVA1 和胡蘿卜的DC8 有相似的功能，本試驗(yàn)已初步驗(yàn)證了GhLEA3 在抗冷方面的功能，其在抗旱中的作用還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

聚類分析表明，GhLEA3 與擬南芥LEA3 蛋白AtECP63[24]親緣關(guān)系最近，同時(shí)與大豆、可可、歐洲白樺、胡蘿卜、葡萄的LEA3 蛋白親緣關(guān)系亦較近，推測(cè)它們可能有相似的功能。研究表明，AtECP63 參與擬南芥種子成熟和種子脫水脅迫過(guò)程[24]；而擬南芥中另一個(gè)LEA3 基因COR15A屬于冷誘導(dǎo)基因[4]，其在低溫條件下表達(dá)量與擬南芥品種的抗凍性呈正相關(guān)[34]，具有保護(hù)細(xì)胞膜的功能[35]，與棉花的LEA3 基因功能相似；另?yè)?jù)Hsing 等[36]報(bào)道，大豆葉片組織中LEA3 的RNA水平在干旱或低溫脅迫條件下明顯提高，其功能也與棉花的LEA3 基因有部分相似之處；Goupil等[37]研究表明，胡蘿卜的LEA3 基因DC8 受脫落酸誘導(dǎo)。GhLEA3 是否具有其他功能還需進(jìn)一步深入研究。

轉(zhuǎn)LEA3 基因可以顯著提高植物的耐低溫能力[16,32]。受低溫脅迫后，GhLEA3 基因在棉花葉片中上調(diào)表達(dá)，且轉(zhuǎn)GhLEA3 基因擬南芥葉片電導(dǎo)率比野生型極顯著降低。這些研究結(jié)果暗示GhLEA3 可能在響應(yīng)低溫脅迫過(guò)程中保護(hù)葉片的細(xì)胞膜，這與玉米ZmLEA3 的功能有相似的地方。Liu 等[32]研究表明，過(guò)表達(dá)ZmLEA3 可以提高轉(zhuǎn)基因煙草和酵母的耐低溫能力，通過(guò)保護(hù)功能蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及與重金屬離子結(jié)合來(lái)保護(hù)植株。由此推測(cè)GhLEA3 基因所表達(dá)的蛋白在低溫條件下也有穩(wěn)定和保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的功能。GhLEA3基因的抗冷功能還需在轉(zhuǎn)基因棉花上進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

4 結(jié)論

陸地棉GhLEA3 屬于典型的LEA3 家族成員，其編碼的蛋白質(zhì)具有親水性；與擬南芥親緣關(guān)系最近，響應(yīng)低溫脅迫，屬于冷誘導(dǎo)型基因。轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)證明GhLEA3 可以提高擬南芥在低溫條件的萌發(fā)能力及葉片的抗冷能力，推測(cè)Gh-LEA3 基因的表達(dá)對(duì)細(xì)胞膜起保護(hù)作用，是棉花適應(yīng)低溫環(huán)境的重要調(diào)控因子。