李敏，李彩紅，趙瑞元，劉冰蕾，張志剛*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長沙410128；2.湖南省棉花科學(xué)研究所，湖南常德415101）

棉花黃萎?。╒erticillium wilt）是1 種世界性的土傳真菌病害，對棉花生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的威脅。該病自20 世紀(jì)30年代由美國傳入中國，歷經(jīng)幾十年時間已蔓延到全國各個棉區(qū)，并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，是棉花可持續(xù)生產(chǎn)的主要障礙之一[1-4]。在中國，引起黃萎病發(fā)生的主要病原物是大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）[5]。大麗輪枝菌致病力變異性強(qiáng)，在與寄主協(xié)同進(jìn)化及受到生態(tài)環(huán)境變化影響的過程中常分化出新致病力類型[1]，而不同致病力的大麗輪枝菌在同一寄主體內(nèi)誘發(fā)的癥狀也會有所差異。因此，不斷研究其致病力分化對于抗黃萎病品種選育及棉花生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

長期以來，很多學(xué)者對中國各主要植棉區(qū)棉花黃萎病菌進(jìn)行了致病力分化研究[1]。湖南省棉花黃萎病的發(fā)生呈日益加劇的態(tài)勢，但到目前為止，有關(guān)湖南省棉區(qū)棉花黃萎病菌情況尚無系統(tǒng)性研究，這在一定程度上間接阻滯了湖南省抗病育種進(jìn)程。本研究以湖南省各主產(chǎn)棉縣（區(qū)）分離的棉花黃萎病菌為研究對象，分析其生理分化和致病力、落葉型分布情況，為該地區(qū)棉花抗病品種選育推廣及棉花黃萎病綜合防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2013年、2014年在棉花黃萎病發(fā)病高峰期（7―8 月）從湖南省各主產(chǎn)棉縣（區(qū)）采集發(fā)病典型的黃萎病病株，采用常規(guī)組織分離法和稀釋平板法[5]，共獲得77 個菌株單孢，其中鼎城區(qū)14株，南縣26 株，澧縣10 株，漢壽縣26 株，安鄉(xiāng)縣1 株。所有菌株于4 ℃低溫冰箱保存。

1.2 培養(yǎng)特性觀察

將保存的各黃萎病菌菌株單孢轉(zhuǎn)接至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato dextrose agar medium，PDA 平板）上，于25 ℃黑暗培養(yǎng)15 d，觀察記載各菌株的菌落形態(tài)、菌絲生長及菌核產(chǎn)生情況，根據(jù)培養(yǎng)特性，將供試病菌劃分為菌核型、菌絲型和中間型[6]。

1.3 生長速率測定

選擇31 個菌株，分別取5 μL 含量106mL－1的孢子懸浮液，滴入查氏（Cazpek）培養(yǎng)基的中央，放置在25 ℃培養(yǎng)，每個菌株重復(fù)4 次。采用十字交叉法，于第5、7、9、11、13 天測量菌落直徑。

1.4 產(chǎn)孢量測定

將用于生長速率測定的31 個菌株在PDA平板上25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，沿菌落邊緣取直徑5 mm 的菌絲塊置于Cazpek 培養(yǎng)基（40 mL），25 ℃，150 r·min－1振蕩培養(yǎng)6 d 后，以血球計數(shù)板（每個菌數(shù)40 個小格）測定其產(chǎn)孢量。

1.5 致病力測定

選擇黃萎病抗性不同的6 個棉花品種作為鑒別寄主，包括抗病品種魯棉研28、中棉所41、豫棉2067，耐病品種中棉所35，感病品種中棉所8 號和冀棉11 號。

將硫酸脫絨的鑒別寄主種子浸泡12 h 后瀝干水分，在溫室條件下播種到營養(yǎng)紙缽中，每重復(fù)6 個缽，待棉苗出土后每缽留苗3～4 株，共3次重復(fù)。

將上述31 個供試菌株活化后接種到Cazpek培養(yǎng)基中，25 ℃黑暗振蕩（150 r·min－1）培養(yǎng)7 d左右，用4 層紗布過濾制成孢子懸浮液，在顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)，將孢子含量調(diào)到1.0×107mL－1，現(xiàn)用現(xiàn)配。待棉苗長到1 片真葉平展時，參照朱荷琴等[7]蛭石沙土無底紙缽定量蘸菌液法進(jìn)行接種，接菌量為每缽15 mL，以接等量清水作為對照。接種后15 d 開始調(diào)查，按全國統(tǒng)一病情分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級調(diào)查，記錄病情。以接種后第24 天調(diào)查的結(jié)果計算病情指數(shù)（Disease index，DI），并以DI 作為劃分反應(yīng)類型（Reaction type，RT）的標(biāo)準(zhǔn)：免疫型（I），病情指數(shù)為0.0；高抗型（HR），病情指數(shù)為0.1～10.0；抗病型（R），病情指數(shù)為10.1～20.0；耐病型（T），病情指數(shù)為20.1～35.0；感病型（S），病情指數(shù)為35.0 以上[8]。

1.6 落葉型檢測

選擇24 個供試菌株，采用CTAB 法提取DNA，以大麗輪枝菌落葉型菌株特異性引物D-1/D-2[9]（5′-CATGTTGCTCTGTTGACTGG-3′/5′-GACACGGTATCTTTGCTGAA-3′） 和非落葉型菌株特異引物ND-1/ND-2[9]（5′-CAGGGGATACTGGTACGAGACG-3′/5′-ATGAGTATTGCCGATAAGAACA-3′） 進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。引物由蘇州金維智生物科技有限公司合成。

PCR 反應(yīng)體系：2×TaqPCR MasterMixⅠ2.5 μL（天根生化科技有限公司）、引物各1.0 μL、模板DNA 0.5 μL、ddH2O 補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性50 s；退火（溫度：D引物41 ℃，ND 引物50 ℃）50 s；72 ℃延伸1 min；共循環(huán)35 次；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

1.7 統(tǒng)計分析

以SAS 9.1.3 統(tǒng)計分析軟件中的聚類分析程序?qū)?1 個棉花黃萎病菌菌株的致病力測定結(jié)果進(jìn)行聚類分析；以SPSS 軟件對致病力、生長速率及產(chǎn)孢量進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株的培養(yǎng)特性

供試菌株在PDA 平板上的菌落形態(tài)差異明顯，根據(jù)微菌核產(chǎn)量及菌落特性，將湖南棉花黃萎病菌劃分為菌核型、菌絲型和中間型3 種培養(yǎng)類型，且每種類型的各個菌株形態(tài)多樣（圖1）。

圖1 不同類型供試菌株培養(yǎng)特性Fig.1 Culture characteristics of different type strains

菌核型菌株共11 個，占14.28%（表1）。該類型表現(xiàn)為產(chǎn)生大量黑色微菌核，中央部分氣生菌絲發(fā)達(dá)。根據(jù)其形態(tài)可分為4 種：（1）黑色菌核部分呈放射狀，菌絲致密；（2）整個菌落表面氣生菌絲發(fā)達(dá)，外圍形成規(guī)則的白色菌絲圈；（3）菌落邊緣呈現(xiàn)不規(guī)則白色菌絲圈；（4）菌落邊緣不整齊，內(nèi)部形成白色菌絲圈。

菌絲型菌株共33 個，占42.85%。根據(jù)其形態(tài)可分為5 種：（1）無菌核產(chǎn)生，菌絲疏松，有輪紋；（2）無菌核產(chǎn)生，菌絲致密，表面有少量氣生菌絲；（3）菌落中央有少量黑色菌核，菌絲致密，有輪紋；（4）菌落中央有少量黑色菌核，無輪紋產(chǎn)生；（5）菌落邊緣呈現(xiàn)白色環(huán)狀圈。

中間型菌株共33 個，占42.85%。此類菌株的菌核大多分布在菌落周圍，形成黑色圓環(huán)，菌落中間為白色。

2.2 供試菌株生長速率和產(chǎn)孢量

對31 個菌株進(jìn)行生長速率和產(chǎn)孢量測定，結(jié)果（表2） 表明：供試菌株生長速率為1.22～2.54 mm·d－1，分離自澧縣的XVd60 及漢壽的XVd61 菌株生長最快，分離自南縣的XVd40 生長最慢；菌株之間產(chǎn)孢量差異較大，其中XVd14產(chǎn)孢量最低，為5.3×106mL－1，XVd2 產(chǎn)孢量最高，為40.6×106mL－1。

2.3 供試菌株致病力鑒定

根據(jù)平均病情指數(shù)以最小距離法對供試菌株的致病力進(jìn)行聚類，31 個黃萎病菌菌株被劃分為致病力強(qiáng)的Ⅰ型、致病力弱的Ⅱ型和致病力中等的Ⅲ型（圖2）。其中：Ⅰ型菌株僅有分離自漢壽的XVd78，占所有供試菌株的3.2%（表3），對6個鑒別寄主的平均病情指數(shù)為43.8，抗病品種中棉所41 和豫棉2067 也表現(xiàn)為感病，病情指數(shù)分別為38.7 和39.8。Ⅱ型菌株在6 個鑒別寄主的平均病情指數(shù)為23.6～26.5，占12.9%，分布在澧縣、南縣和漢壽。Ⅲ型菌株在6 個鑒別寄主的平均病情指數(shù)為29.1～41.9，占比最大，為83.9%，

在湖南省各個地區(qū)均有分布。綜合31 個供試菌株對所有鑒別寄主的病情指數(shù)分析，抗病水平最高的品種是魯棉研28，其次是中棉所41，抗病水平最低的為冀棉11 號。

表1 77個菌株培養(yǎng)類型Table 1 Culturing types of 77 strains

表2 31個菌株產(chǎn)孢量及生長速率Table 2 The sporulation quantity and growth rates of 31 strains

圖2 31個菌株基于平均病情指數(shù)的系統(tǒng)聚類圖Fig.2 Dendrogram of 31 strains based on averaged disease indexes

表3 31個棉花黃萎病菌株對6個鑒別寄主的致病性Table 3 Pathogenicity of 31 strains of V.dahliae to six different hosts

2.4 供試菌株致病型PCR檢測

如圖3 所示，24 個供試菌株由落葉型特異性引物均擴(kuò)增出大小為550 bp 的目的條帶，而由非落葉型特異性引物則擴(kuò)增不出條帶。表明湖南地區(qū)棉田采集到的黃萎病菌主要為落葉型菌株。

圖3 D-1/D-2 PCR檢測供試菌株的致病型Fig.3 The pathotype of the tested strains by PCR assay with primers D-1/D-2

3 討論

3.1 湖南省棉花黃萎病菌的培養(yǎng)類型

77 個菌株可按照培養(yǎng)特性被分為菌核型、菌絲型及中間型，其中菌核型占比最小，菌絲型和中間型占比相等，表明湖南地區(qū)的棉花黃萎病菌以菌絲型和中間型為主。此結(jié)果與李彩紅等[10]于2015年對湖南常德地區(qū)棉花黃萎病監(jiān)測結(jié)果有所差異，后者中菌絲型占比最大，達(dá)67.6%。原因可能是湖南地區(qū)棉花黃萎病菌分化速度較快，且優(yōu)勢種群正處于變化中。而在全國范圍，2007年以后江蘇[8]、河南[11]、新疆[12]、河北[13]等地報道的棉花黃萎病菌以菌核型為主，表明菌核型正在這些地區(qū)成為優(yōu)勢種群，這一趨勢與湖南省情況不同。本研究中菌核型和菌絲型2 種類型的菌株菌落表現(xiàn)出形態(tài)多樣性，且跟其他省份所報道的形態(tài)差異較大[8,11-12,14-15]，這表明棉花黃萎病菌在不同地區(qū)的分化差異較大。

3.2 湖南省棉花黃萎病菌致病力分化情況

本研究在鑒別寄主的選擇上參考了袁媛等[16]的研究，該研究以我國三大棉區(qū)黃萎菌菌株為對象，篩選確定了一套棉花黃萎病菌致病力測定的鑒別寄主，這在一定程度上增強(qiáng)了本研究致病力測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。從致病力測定結(jié)果來看，湖南省各主產(chǎn)區(qū)棉花黃萎病菌存在較大差異，且以III 型為主，占供試菌株的83.9%。所有6 個鑒別寄主對77.4%的供試菌株表現(xiàn)耐病或感病，表明湖南省棉花黃萎病菌具有較強(qiáng)的致病力。31 個供試菌株致病力與生長速率之間的相關(guān)系數(shù)為0.190，與產(chǎn)孢量之間的相關(guān)系數(shù)為0.155，表明致病力與生長速率、產(chǎn)孢量均無顯著相關(guān)性，這與林玲等[8]、劉廷利等[12]研究結(jié)果一致，也在一定程度上說明湖南棉花主產(chǎn)區(qū)黃萎病菌分化嚴(yán)重。

棉花黃萎病菌致病力與培養(yǎng)特性的相關(guān)性，一直是學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。朱荷琴等[17]和李艷等[18]研究認(rèn)為，棉花黃萎病菌株致病力與生長速率呈正相關(guān)，且與培養(yǎng)特性存在相關(guān)性；林玲等[19]研究報道，江蘇省棉花黃萎病菌致病力與產(chǎn)孢量的關(guān)系不明顯。近年來，多數(shù)研究棉花黃萎病致病機(jī)制的報道則表明，病原菌的生長速率、產(chǎn)孢量與致病力有一定相關(guān)性[20-22]；但病原菌對寄主致病并不是單一的信號傳導(dǎo)事件，往往是多種信號途徑交叉影響的結(jié)果[23-24]。

3.3 湖南省棉花黃萎病菌致病型

本研究利用PCR 技術(shù)檢測湖南省棉花主產(chǎn)區(qū)黃萎病菌的致病型，落葉型菌株占100%。該結(jié)果從分子水平上論證了落葉型菌株是當(dāng)前湖南省棉花黃萎病菌優(yōu)勢種群，與王彥等[25]、徐飛[26]的研究結(jié)果“華中地區(qū)棉花主產(chǎn)區(qū)以落葉型黃萎病菌為主”一致。由于本試驗僅選取了24 個菌株為研究對象，尚需擴(kuò)大供試菌株樣本量進(jìn)行進(jìn)一步研究。此外，大麗輪枝菌特異性引物PCR 法是被普遍認(rèn)同的鑒定棉花黃萎病致病類型的方法，但朱荷琴等[24]認(rèn)為能否侵染棉花并引發(fā)典型的落葉癥狀才是判斷落葉型菌株最重要的指標(biāo)。因此，落葉型菌株是否為湖南省優(yōu)勢種群仍需擴(kuò)大樣本量并結(jié)合生物測定進(jìn)行進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

本研究對湖南省棉花主產(chǎn)區(qū)分離到的77 個棉花黃萎病菌菌株進(jìn)行了培養(yǎng)特性分析，進(jìn)一步分析了其中31 個菌株的生長速率、 產(chǎn)孢量及致病力，明確了湖南省棉花黃萎病菌主要培養(yǎng)類型由菌絲型變化為菌絲型和中間型，致病型以落葉型為主，致病力以Ⅲ型為主。同時，湖南省棉花黃萎病菌分化速度較快且致病力分化嚴(yán)重，針對這一現(xiàn)狀結(jié)合簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增（Inter-simple sequence repeat-PCR，ISSR-PCR） 等技術(shù)手段對其進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測是十分必要的。