韓建福，富敏霞，祝鈴鈺，贠軍賢

(浙江工業(yè)大學化學工程學院，浙江杭州310032)

苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)，也稱作2-氨基-3-苯基丙酸，它是一種手性分子，有L-苯丙氨酸(L-Phe)和D-苯丙氨酸2種存在的手性形式，結構式如圖1所示。苯丙氨酸的分子式為C9H11NO2，分子量為165.19，外觀為無色至白色片狀晶體或結晶性粉末，苦杏仁味；室溫下不溶于乙醚，微溶于乙醇，溶于水；在空氣中受熱、光照穩(wěn)定。其中，具有生物活性的光學異構體為L-苯丙氨酸，比旋度為-35.1°，等電點pI=5.48，熔點為283 ℃。L-Phe是一種重要的氨基酸，為人體必需的8種氨基酸之一，人和動物自身無法合成，必須從外界攝取[1]。

圖1 苯丙氨酸的2種對映異構體Fig.1 Two enantiomers of phenylalanine

近年來，新型甜味劑阿斯巴甜的市場需求量日益增大，L-Phe作為生產阿斯巴甜的主要原料，其需求迅速增大[2-3]。同時，L-Phe也廣泛用于藥物活性化合物，如抗炎藥、中樞神經系統(tǒng)神經肽、HIV蛋白酶抑制劑和維生素B6等，在醫(yī)藥領域的應用越來越受到重視[4-5]。目前國內生產的L-Phe已不能滿足需求，進口份額越來越大[6-7]。良好的市場需求前景，使國內外越來越多地關注光學純L-Phe生產技術的研究。因此，本文中，筆者對化學合成法、酶促合成法和微生物發(fā)酵法獲得光學純L-Phe 的研究情況進行綜述。

1 化學合成法

Phe的化學合成法大體可以分為以下幾種：氰氨法、酰氨基丙二酸乙酯法、苯甲醛的縮合反應法和α-取代基脂肪酸氨化法等[8-11]。這幾種方法最終得到的是苯丙氨酸的D型和L型手性混合體，要得到光學純L-苯丙氨酸，則需要對這些產物進行拆分。根據D/L-Phe拆分的手段和原理不同，常用的拆分方法主要包括萃取拆分法[12]、膜拆分法[13]、分子印跡技術[14-15]和酶拆分法[16-17]等。這幾年，很多學者重點研究了通過化學合成法直接得到手性L-Phe。吳建一等[18]以甘氨酸為起始原料，在保護氨基和羧基條件下合成苯亞甲氨基乙酸乙酯，然后經鹵代烴在手性轉移催化劑的催化下反應生成烴化產物，經酸性水解得到L-Phe，產率40.1%。

化學合成法制備L-Phe生產路線長，使用有毒化學試劑原料，副產物多，環(huán)境污染大，且產物為光學消旋體，需進行光學拆分，成本高，因而逐漸被淘汰。而酶促合成法和微生物發(fā)酵法制備Phe往往能得到高光學純度的D-或L-Phe，過程更加環(huán)保，并利用葡萄糖、蔗糖、玉米漿和甘油等可再生資源[4,19-20]。近幾年，國內外學者對Phe的研究已轉向酶促合成法和微生物合成轉化方法。

2 酶促合成法

酶促法合成L-Phe是利用微生物中的酶系高效專一地催化底物來合成L-Phe。酶法生產L-Phe主要有兩種方法：一是以苯丙酮酸為底物，利用苯丙氨酸轉氨酶生成L-Phe；二是以肉桂酸為底物，利用苯丙氨酸解氨酶(PAL)生成L-Phe，此法不需要昂貴的輔酶系統(tǒng)或者再輔酶生系統(tǒng)[21]，因而應用較為廣泛。

Anzawa等[22]利用弗氏檸檬酸桿菌的轉氨酶催化苯丙酮酸生成L-苯丙氨酸，目前已培養(yǎng)出能夠產生大量PAL的重組菌株。當以L-谷氨酸為氨基供體時，在優(yōu)化的條件下肉桂酸轉化率可達80%以上。而在生物轉化期間，細胞中的重組PAL活性迅速下降。因此，提高重組PAL的穩(wěn)定性對提高L-Phe產量是必需的。Zhang等[23]應用中心復合設計優(yōu)化重組PAL穩(wěn)定性關鍵因素的綜合效應，改善大腸桿菌中重組PAL的穩(wěn)定性，測試變量的最佳值為13.04 mmol甘油、1.87 mmol/L蔗糖、4.09 mmol/L二硫蘇糖醇和69 mmol/L Mg2+，在3次連續(xù)的生物轉化循環(huán)后，PAL最大活性保持為67.73 U/g；與最初的PAL活性相比，PAL活性的損失僅為22%；與對照實驗相比，PAL活性增強約23%(不含任何穩(wěn)定劑或添加劑)。在連續(xù)的生物轉化期間，PAL穩(wěn)定性顯著改善，可有助于工業(yè)規(guī)模的L-Phe生產。此外，Yue等[24]研究發(fā)現一定量的β-環(huán)糊精有利于提高PAL的活性，進而提高L-Phe的生產率。

酶促合成法生產工藝簡單、產品光學純度高、純化步驟簡便且生產能力較強，是目前工業(yè)化生產L-Phe的主要方法之一。然而，近年來，由于底物和酶等主要原料成本高、來源有限以及反應過程中酶穩(wěn)定性差等缺點，酶促合成法生產L-Phe的規(guī)模也受到了很大制約。

3 微生物發(fā)酵法

微生物具有生長繁殖迅速可控、原料廉價易得、反應條件溫和、環(huán)境污染小及生產周期短等優(yōu)點，成為L-Phe合成的研究熱點。微生物利用碳源和氮源進行發(fā)酵，可以大量生產L-Phe。用于合成苯丙氨酸的微生物菌株有：枯草芽孢桿菌、粘紅酵母菌、短桿菌、假單胞菌、大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌以及一些工程菌等[25-30]，目前工業(yè)上發(fā)酵生產L-苯丙氨酸的菌株主要為大腸桿菌。

3.1 發(fā)酵法合成機制

微生物中，L-Phe的合成代謝途徑是從葡萄糖開始，包括以下3個途徑[28,30-32]：中心碳源代謝途徑、莽草酸途徑和分支酸途徑。葡萄糖經糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和四磷酸赤糖(E4P)2個前體物質，它們首先在3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶(DAHPS)催化下縮合成3-脫氧-D阿拉伯庚酮酸糖-7磷酸(DAHP)進入莽草酸途徑，在經過一系列的酶促反應到達L-Phe合成途徑的分支點——分支酸。一方面分支酸在鄰氨基苯甲酸合酶作用下進入L-色氨酸(L-Trp)合成途徑。另一方面分支酸經分支酸變位酶(CM)生成預苯酸，預苯酸經預苯酸脫水酶(PDT)作用生成L-苯丙酮酸，再經氨基轉移酶(AT)作用生成L-Phe；或預苯酸經預苯酸脫氫酶和氨基轉移酶進入L-酪氨酸(L-Tyr)合成途徑。谷氨酸棒桿菌中DAHPS調控機制要比大腸桿菌復雜得多，DAHPS分別由aroF和aroG這2個基因編碼，其中，aroF基因編碼的AroF酶主要受到L-Tyr反饋抑制，aroG基因編碼AroG酶會受到L-Phe的反饋抑制，同時在CM酶的存在下，受到預苯酸和分支酸的協(xié)同反饋抑制[33-34]。在谷氨酸棒桿菌中，由csm和pheA2個基因編碼CM、PDT的2個酶分別催化分支酸生成預苯酸，進而生成苯丙酮酸[35]，PDT酶受到產物L-Phe的反饋抑制[36-37]。大腸桿菌L-Phe的合成途徑如圖2所示。

圖2 大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中L-Phe合成代謝途徑Fig.2 L-phenylalanine biosynthesis pathway in E.coli (a) and C. glutamicum (b)

由圖2可知：L-Phe合成途徑內存在3個節(jié)點[38-39]：①2個前體物質合成DAHP節(jié)點，在大腸桿菌調控機制中，DAHP由中心碳源途徑過渡到莽草酸途徑，它的量決定了所有下游代謝產物的流量；②分支酸向L-Trp合成節(jié)點，在此節(jié)點抑制分支酸向L-Trp方向流動，即可促進分支酸向L-Tyr和L-Phe方向流動；③預苯酸向L-Tyr和L-Phe分支節(jié)點，在此節(jié)點通過抑制預苯酸向L-Tyr方向移動，即可促進L-Phe合成。作用于這幾個節(jié)點的酶和基因(表1)，便是整個芳香族氨基酸合成途徑中的重要調控位點。DAHPS由3個同工酶AroH、AroF和AroG構成，分別由aroH、aroF和aroG3個基因編碼，這3個基因決定了其活性，并受L-Trp、L-Tyr和L-Phe的反饋抑制[30,40]。大腸桿菌中另外2個節(jié)點受到由pheA基因編碼的雙功能酶分支酸變位酶——預苯酸脫水酶(CM-PDT)影響，并受到產物L-Phe反饋抑制[41]。

3.2 發(fā)酵法合成應用

L-Phe的合成代謝途徑比較復雜，涉及的酶類較多(表1)，可對途徑內的幾個分支點進行代謝流的優(yōu)化和調控，加強重要前體物質DAHP的合成，同時也可對途徑間的競爭抑制進行消除，或消除途徑內的反饋抑制，是目前獲得高產量L-Phe的研究熱點。近幾年，微生物發(fā)酵法生產L-Phe的主要關注點包括：通過基因工程技術構建重組菌體提高或抑制關鍵酶表達，優(yōu)化發(fā)酵過程[26,42-44]，尋找新的工程菌株等。

表1 大腸桿菌中L-Phe合成代謝關鍵酶及控制基因[40]

3.2.1 構建重組菌株

在正常條件下，在野生型菌株中只有少量的中心代謝物轉化為L-Phe。由L-Phe合成代謝機制可知，促進微生物合成L-Phe的方法有：促進前體物質DAHP的合成，抑制L-Trp、L-Tyr與L-Phe合成途徑間的競爭，解除合成途徑內的反饋抑制。由于編碼L-Phe生物合成的基因在大腸桿菌和其他微生物中有很好的表達，因此理論上可通過關鍵酶基因的克隆和過量表達以增加關鍵酶合成，進而提高微生物中L-Phe的生產能力。目前，關鍵酶的篩選及其在L-Phe發(fā)酵法生產中得到了深入研究和廣泛應用，極大地促進了微生物發(fā)酵法生產L-Phe的工業(yè)化進程。Ding等[45]通過蛋白質組學方法和體外酶滴定實驗確定參與莽草酸途徑的6種酶(AroK、AroL、AroA、AroC、PheA和TyrB)的絕對濃度，實現了這6種酶的體外反應體系的重建，并測試了它們對L-Phe生產的影響，結果發(fā)現，當莽草酸激酶和5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶濃度增加2.5倍時，L-Phe的產量分別增加3.0倍和2.1倍。

在大腸桿菌中，目前主要通過基因工程促進PEP、E4P的合成和DAHPS酶的過表達提高DAHP的流量，進而提高L-Phe產量。在大腸桿菌中，PpsA通過轉磷酸化反應催化丙酮酸合成PEP，而TktA催化合成E4P[46]。PpsA和PckA分別由ppsA和pckA基因編碼。因此可通過過度表達ppsA和pckA基因來提高DAHP合成基質PEP和E4P的產量。目前已經成功構建了一系列具有不同變體的重組大腸桿菌菌株用于L-Phe的高水平生產。研究表明ppsA基因在大腸桿菌中的過度表達將DAHP水平提高了1.9倍[47]。在大腸桿菌細胞中，PckA過表達將L-Phe產生的摩爾轉化產率增加了20%[48]。

AroG和AroF同工酶都被約0.1 mmol/L的相應氨基酸完全抑制，但AroH僅被L-Trp部分抑制，增強DAHPS活性是過量生產L-Phe及其前體莽草酸的重要方法。消除L-Phe對關鍵酶的反饋抑制和tyrA基因的缺失可以提高L-Phe生物合成的產量。此外在L-Phe生產過程中，通常使用L-Tyr營養(yǎng)缺陷型生產菌株來避免不需要的碳流入L-Tyr合成途徑。

2017年，Liu等[49]開發(fā)了一種轉錄因子(TF)驅動的能特異性地感知細胞內L-Phe，并將該信號轉化為可觀察的類型。通過這種策略，建立了高靈敏度和寬動態(tài)范圍的HTS平臺，以促進高L-Phe產量的新型生產商的表征、鑒定和分離。這種方法使研究者能夠在短時間內從突變文庫中獲得大量新的感興趣的表型，并提供對大腸桿菌中L-Phe生物合成途徑復雜調控的深入了解?；赥F的生物傳感器的超敏性和特異性，各種基因設備已被用于優(yōu)化合成途徑并預測目標代謝產物的潛在瓶頸[50-52]。此外，通過從隨機誘變文庫中篩選L-Phe高產表型來研究該生物傳感器的適用性，結果表明，這種新型L-Phe反應裝置可用作改善大腸桿菌中L-Phe產生的有效篩選工具。部分大腸桿菌中L-Phe合成代謝特征及文獻總結見表2。

表2 大腸桿菌中L-Phe的合成代謝

3.2.2 優(yōu)化發(fā)酵過程

為了制備經濟上可行的產品，在實驗室規(guī)模開發(fā)和測試的過程必須適應工業(yè)上更大的生產量，但通常由于放大效應而導致生產性能顯著下降[53]。因此，為防止大腸桿菌放大過程中由發(fā)酵參數異質性引起的生理變化，優(yōu)化發(fā)酵過程就很有必要。各種發(fā)酵方法和技術已被開發(fā)用于改進L-Phe的生產[54]，例如培養(yǎng)基優(yōu)化、底物進料速率控制、O2供應速率控制和過程設計等。

在過去幾年中，甘油已成為高效生產L-Phe的主要碳源。與葡萄糖相比，低成本及更高碳轉化率的甘油能夠有效降低工業(yè)生產成本。在大腸桿菌中，甘油通過擴散穿過細胞質膜，隨后通過甘油激酶(GlpK)將細胞內甘油轉化為甘油3-磷酸(G3P)，然后細胞內G3P通過G3P脫氫酶的作用氧化形成磷酸二羥丙酮(DHAP)，后者又異構化成甘油醛-3-磷酸(GA3P)。DHAP和GA3P在糖酵解途徑、戊糖磷酸途徑和芳香族氨基酸生物合成途徑中進一步代謝。由于L-苯丙氨酸脫氫酶活性參與了大腸桿菌L-Phe合成的最后一步，Thongchuang等[55]將來自耐熱芽孢桿菌遲緩芽孢桿菌的苯丙氨酸脫氫酶基因(phedh)、編碼芳香族氨基酸出口的yddG基因和編碼甘油轉運促進子的glpF基因克隆到質粒中并在大腸桿菌中共表達。在甘油培養(yǎng)基中，克隆pPY(phedh和yddG)和pPYF(phedh、yddG和glpF基因)的工程菌，L-Phe最大產率分別比pPheDH克隆的高1.4倍和1.8倍。

補料分批培養(yǎng)是工業(yè)生產L-Phe的常用方法，因為它能增加細胞密度，嚴格控制底物濃度和溶氧以防止發(fā)酵途徑的激活[56]。Weiner等[57]以甘油為碳源，在分批補料條件下，研究了大腸桿菌 FUS4代謝生成L-Phe的過程，發(fā)酵76 h后L-Phe產量達到22.8 g/L。Wu等[58]使用溫度敏感性質粒，過量共表達抗反饋抑制突變體pheAfbr以及野生型aroF和透明顫菌血紅蛋白基因，研究了溶氧條件對其發(fā)酵產物的影響，結果表明，高溶氧濃度下L-Phe產量達44.21 g/L。2011年，Zhou等[44]在大腸桿菌BR-42發(fā)酵罐中進行發(fā)酵優(yōu)化，研究恒速給料、線性遞減給料和指數給料對L-Phe產生的影響，結果表明L-Phe的最終產量高達57.63 g/L。2015年，Yuan等[21]采用分階段指數型進料L-Tyr，與指數進料相比，最終L-Phe產量增加15.33%，L-Tyr補充量降低45.38%。此外補料分批策略可以在一定程度上解決副產物醋酸帶來的問題。

通常利用大腸桿菌工程菌株生產L-Phe需要較高的供氧率。在實際生產中，常通過增加曝氣速度和攪拌速度以及純O2補充來增加O2供應。但是高O2供應可能會導致功耗過大和整體工藝成本增加。Wu等[58]研究發(fā)現，由tac啟動子驅動的透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)與aroF和pheAfbr基因的共表達，能夠提高產率并減少大腸桿菌CICC10245曝氣的需求。當vgb、aroF和pheAfbr一起表達時導致L-Phe生產顯著增加，最高可增加4.13倍。另外，在限氧條件下，大腸桿菌CICC10245產生L-Phe的量明顯少于高通氣條件下的結果。大腸桿菌菌株PAPV在高通氣條件下產生約6.23 g/L的L-Phe，而在低通氣條件下產生約5.82 g/L的L-Phe。

最后，生物過程設計也是L-Phe生產的重要因素。L-Phe的生物合成是最復雜的氨基酸合成途徑之一。2014年，Liu等[59]探究了L-Phe系統(tǒng)級工程化生產：①通過失活crr來減少葡萄糖特異性磷酸烯醇丙酮酸-碳水化合物磷酸轉移酶(PTS)系統(tǒng)，以減少葡萄糖攝取率以減少溢出代謝；②開啟或關閉phefbr、aroG15、ydiB、aroK和tyrB基因的表達以增加前體的供應；③采用tyrA突變株來減少碳轉移并導致非生長細胞；④通過過量表達yddG來增加L-Phe的外排，使平衡向L-Phe合成移動進行反饋調節(jié)。首先比較PTS中的突變體并首先篩選crr突變體，表達yddG的菌株以較高的速率向培養(yǎng)基中分泌L-Phe，并且只有較少L-Phe在細胞內積累。通過系統(tǒng)工程，L-Phe產量高達47.0 g/L，這是非優(yōu)化發(fā)酵條件下最高的。2018年，Liu等[60]研究發(fā)現，在未優(yōu)化的發(fā)酵條件下，通過系統(tǒng)級工程5 L發(fā)酵罐中Xllp21菌株的L-Phe產量達到72.9 g/L，是原始菌株Xllp01的1.62倍。

3.2.3 尋找新菌株

盡管可以產生較高濃度的L-Phe，但大腸桿菌工程菌在工業(yè)化生產L-Phe時遇到了許多問題，特別是噬菌體感染致使發(fā)酵終止[61]。因而需要尋找穩(wěn)定的替代工程菌株，如谷氨酸棒桿菌。谷氨酸棒桿菌具有生長速度快、缺乏內毒素、分離過程簡單等優(yōu)點，同時隨著現代分子生物學技術的發(fā)展，谷氨酸棒桿菌基因測序已完成，基因操作工具也已成熟[62-63]，代謝工程谷氨酸棒桿菌生產L-Phe取得了顯著效果[64]。

谷氨酸棒桿菌的研究主要集中在表達解除反饋抑制的關鍵酶。為了改善谷氨酸棒狀桿菌中L-Phe的積累，Zhang等[23]在谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中異源表達大腸桿菌來源的DAHPS和CM-PDT，最終獲得L-Phe產量為4.64 g/L，是出發(fā)菌的29倍，說明過量表達這2個關鍵酶能顯著提高L-Phe的積累量。同時，使用正交試驗設計及響應面優(yōu)化法，分別對種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，確定了重組谷氨酸棒桿菌發(fā)酵L-Phe的最佳種子培養(yǎng)基及最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，最終在最佳培養(yǎng)基條件下L-Phe產量高達9.14 g/L，比優(yōu)化前的7.46 g/L提高了22.5%[31]。Zhang等[23]分析了谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032中莽草酸和分支酸途徑的關鍵酶，發(fā)現通過突變的pheA和野生型aroH基因的共表達，L-Phe增加了13.6倍。Liu 等[64]將aroG-pheA整合到谷氨酸棒桿菌染色體中由于生物合成途徑中關鍵酶活性的改善，也有利于L-Phe的合成。這兩個因素使得L-Phe生物合成產量增加了30%。

4 結論與展望

對近年來國內外L-苯丙氨酸制備的研究進展進行了綜述，主要結論如下：

1)L-Phe制備方法有多種，但微生物發(fā)酵法由于具有原料廉價易得、環(huán)境污染較小、產物純度高等優(yōu)點，是目前國內外工業(yè)化生產L-Phe的主要方法。

2)根據L-Phe代謝機制，對途徑內的幾個分支點進行代謝流的優(yōu)化和控制，是微生物發(fā)酵獲得高濃度L-Phe的有效方法。

3)谷氨酸棒桿菌具有速度快、缺乏內毒素、分離過程簡單等優(yōu)點，在一定程度上可以克服大腸桿菌工程菌株的一些局限，是L-Phe微生物發(fā)酵合成的潛在菌種，成為當前研究的主要方向之一。

目前，微生物發(fā)酵合成L-Phe已經實現了工業(yè)化，但仍存在亟待解決的問題。因此，下一步需要進一步開展研究，例如進行菌種的篩選和高產工程菌株的構建，以獲得性能更加優(yōu)良的生產菌株；同時，對發(fā)酵工藝和過程進行優(yōu)化，來提高L-Phe的產量；對于L-Phe的代謝流調控和代謝機制進行更加深入詳細的研究等。隨著深入研究，L-Phe的應用會不斷擴大，在不同工業(yè)領域將有更廣闊的前景。