李曉潔，姜俊，周瑞芳，刁愛芹，鄭濤，葉軍

(1.泰州職業(yè)技術學院醫(yī)學技術學院基礎與藥學教研室；2.泰州市人民醫(yī)院中心實驗室，江蘇 泰州 225300)

短期內患者體重快速下降是多種腫瘤共同的臨床表現(xiàn)之一，患者體重下降的可能原因是腫瘤細胞快速生長時需攝取體內大量營養(yǎng)物質，為其生理活動提供能量。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞主要通過糖酵解的方式供能，產熱量低，攝食供能低于機體所需熱量，導致機體正常細胞能量不足[1]，必須通過消耗自身組織以滿足生命活動能量需求。若3個月來漸進性消瘦，體重比原始體重(診斷時)下降≥7.5%，或IBM指標<80%即診斷為惡病質[2]。Solheim等[3]認為惡病質的異常代謝，引起免疫力下降，可能刺激腫瘤細胞的生長和增殖。因此預防和延緩惡病質的發(fā)生對腫瘤治療有重要意義。惡病質的發(fā)生機制目前尚不清楚。

唾液酸酶主要參與調解機體內唾液酸的含量[4-5]，目前根據反應底物和亞細胞定位分為四型[6-8]，其中第三型主要定位在質膜[9]，因此命名為質膜型唾液酸酶(human plasma membrane-associated sialidase，Neu3)。Neu3在多種腫瘤組織中高表達，如前列腺癌[10]、結腸癌[11]、卵巢癌[12]、神經膠質細胞瘤[13]等。

本研究建立前列腺癌原位腫瘤模型，觀察Neu3不同表達水平干預措施后，裸鼠攝食量、體重等的變化，通過體外實驗觀察Neu3不同表達水平對細胞活性、遷移能力的影響，探尋Neu3影響惡病質的可能機制，研究成果有助于尋找延緩惡病質發(fā)生、發(fā)展，改善患者生存質量，延長生存期的藥物。

1 材料和方法

1.1 主要儀器

移液器(JILSON公司)、低溫高速離心機、-80 ℃低溫冰箱、自動高壓蒸汽消毒器(SONY公司)、CO2恒溫培養(yǎng)箱(SANYO公司)、電轉儀、YZ-875超凈工作臺、無菌動物飼養(yǎng)隔離器、電子天平。

1.2 主要試劑

IMDM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(GBICO 美國)、胎牛血清(Hyclone公司)、MTT(SIGMA 美國)LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)、IL-6 Mouse ELISA Kit (InvitrogenTM)試劑盒。

1.3 質粒、菌種及細胞系

PC-3、LNCaP細胞均購于美國標準菌庫，質粒pGCsilencer-U6/Neo/GFP購于上海吉凱化學公司，pGCsi-Neu3質粒為作者研究生期間在吉林大學病理學與病理生理學實驗室構建，干預效率大于50%，減毒沙門氏菌為吉林大學病理生理學實驗室所保存。

1.4 細胞培養(yǎng)及轉染實驗

PC-3、LNCaP細胞按ATCC培養(yǎng)條件：用含有100 μg/mL青鏈霉素IMDM(Hyclone,USA) 、10%胎牛血清的培養(yǎng)液在37 ℃含5% CO2孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)前列腺癌PC-3細胞并傳代。轉染操作參照Lip2000說明，只加入轉染試劑實驗分組命名為Mock，轉染陰性質粒pGCsi-Scramble的實驗分組命名為pGCsi-Scramble，轉染pGCsi-Neu3質粒實驗分組命名為pGCsi-Neu3，Mock和pGCsi-Scramble統(tǒng)稱為對照組。

1.5 MTT實驗

取對數(shù)生長期的PC-3、LNCaP細胞，按照轉染實驗分組，每組設有5個重復孔，MTT法測定各孔的OD值，間接衡量細胞增殖能力。

1.6 減毒沙門氏菌感受態(tài)電轉導入目的基因及干涉效率檢測

在預冷后的電轉杯中加入1 μL質粒和100 μL減毒沙門氏菌，在參數(shù)為：電壓600 V，單次電擊，電擊持續(xù)時間30 ms的條件下進行目的基因導入操作?；旌衔锏斡诤珹mp的LB平板 37 ℃培養(yǎng)16～20 h。選取單菌落，轉移至LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，待OD600大約為0.4時保存菌液，并將其中一部分并送上海吉凱化學公司測序，檢測是否構建成功。通過RT-PCR和Western Blotting兩種方法檢測在體內是否可發(fā)揮體外類似的沉默效率。

1.7 人前列腺癌裸鼠腫瘤原位模型的建立及處理

將購置的6周左右BALB/C nu/nu雄性裸鼠飼養(yǎng)于大型恒溫無菌硬塑隔離器。按照每只小鼠注射100 μL細胞懸液，細胞懸液濃度為2.0×107/mL的參數(shù)進行腫瘤皮下模型的制備。當皮下腫瘤生長至最大直徑為0.5 cm時，在無菌環(huán)境中分離皮下腫瘤，并割成2×2×2 mm3大小的瘤塊，為后續(xù)腫瘤原位模型做準備[10]。將腫瘤原位模型術后狀態(tài)良好的小鼠隨機分組，每組6只。對照組(Mock)給予PBS，Attenuated Salmonella組(AS)給予減毒沙門氏菌，pGCsi-Scramble質粒組(pGCsi-Scramble)給予攜帶pGCsi-Scramble質粒的減毒沙門氏菌，pGCsi-Neu3質粒組(pGCsi-Neu3)攜帶pGCsi-Neu3質粒的減毒沙門氏菌。通過尾靜脈給藥的方式進行給藥。每兩周給予一次，共給兩次。在4、8、12、16等4的倍數(shù)的時間點檢測裸鼠的進食量、體重。每組老鼠的進食量=(初始投放食物量-檢測時間點實際食物量)/(天數(shù))。

1.8 ELASA 法測定裸鼠血清IL-6的水平

選用IL-6 Mouse ELISA Kit (InvitrogenTM)試劑盒，測定過程參照試劑說明書完成。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包處理，應用Excel作圖。用F檢驗首先進行方差分析，以q檢驗判斷差異顯著性，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 倒置顯微鏡下觀察pGCsi-Neu3質粒對腫瘤細胞形態(tài)的影響

PC-3細胞轉染pGCsi-Neu3質粒24 h后，細胞透光性降低，細胞變圓，偽足減少，產生大量漂浮細胞，對照組細胞呈現(xiàn)梭型，透亮度好，少見漂浮細胞，見圖1A。LNCaP細胞轉染pGCsi-Neu3細胞發(fā)生與PC-3細胞類似的形態(tài)學變化，見圖1B。

2.2 MTT檢測腫瘤細胞轉染后細胞增殖變化

PC-3細胞轉染pGCsi-Neu3質粒后，在24 h、48 h、72 h等時間點檢測細胞數(shù)目，其結果顯示轉染pGCsi-Neu3質粒后細胞數(shù)目增長速度明顯減慢，與對照組相比有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖2A。LNCaP細胞轉染pGCsi-Neu3質粒后獲得與PC-3細胞類似的趨勢，見圖2B。

2.3 劃痕實驗檢測細胞轉染pGCsi-Neu3質粒細胞遷移能力的改變

轉染后分別在0 h、12 h、24 h拍照并測量劃痕寬度，結果顯示轉染12 h后，對照組(Mock)以及轉染空質粒組(pGCsi-Scramble)細胞出現(xiàn)明顯遷移，轉染24 h后，轉染pGCsi-Neu3質粒組細胞遷移的距離與對照組(Mock)以及轉染空質粒組(pGCsi-Scramble)細胞遷移距離與相比差異明顯減小，有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.4 裸鼠進食量的檢測

裸鼠進食量數(shù)據顯示Mock組以及AS組和pGCsi-Scramble組，裸鼠進食量逐漸減少，試驗結束時，與pGCsi-Neu3實驗組相比進食量差異明顯(P<0.05，P<0.01)。見圖4。

2.5 裸鼠體重的檢測

裸鼠體重數(shù)據顯示Mock組以及AS組和pGCsi-Scramble組裸鼠體重逐漸減輕。第20天起與pGCsi-Neu3實驗組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；試驗結束時，與pGCsi-Neu3實驗組相比體重差異明顯(P<0.01)，見圖5。

2.6 裸鼠腫瘤組織Neu的表達

取不同分組的腫瘤組織，通過RT-PCR和Western Blotting 檢測通過減毒沙門氏菌運載后，在體內Neu3在RNA和蛋白水平的沉默效率。見圖6。

2.7 裸鼠血清IL-6的檢測結果

裸鼠血清IL-6檢測結果顯示：Mock組以及AS組和pGCsi-Scramble組IL-6水平分別為(121.76±34.25)pg/mL，(118.76±30.89)pg/mL，(116.76±32.46)pg/mL。pGCsi-Neu3組IL-6水平為(60.76±20.88)pg/mL，與Mock組以及AS組和pGCsi-Scramble組相比IL-6水平明顯下降。

3 討論

惡病質主要表現(xiàn)為患者食欲差，進食量下降，體重非意愿性逐漸下降，外形呈現(xiàn)皮包骨頭。腫瘤末期大約有80%的病人會發(fā)生惡病質[14-15]。很多腫瘤患者并非死于腫瘤本身，而是死于惡病質[16-17]。研究數(shù)據表明：腫瘤患者體重下降30%，肌肉蛋白儲備下降75%，是預示生存率降低的獨立危險因素[18]。由于腫瘤細胞進行糖酵解進行供能，產熱量低，可能導致機體所需進食量與患者實際進食量差值變大，因此機體需要分解自身成分用于供能。本實驗下調Neu3表達，通過光鏡觀察到細胞透亮度降低，偽足數(shù)量減少。通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)當Neu3表達水平下降時細胞增殖能力下降；劃痕實驗證實細胞遷移能力下降。利用減速沙門氏菌作為運載體進行靶向治療。前列腺癌荷瘤小鼠Mock組、AS組和pGCsi-Scramble組小鼠在實驗過程中，體重不斷下降，攝食量減少，精神狀態(tài)較差，活動較少，逐步出現(xiàn)惡病質征象，在實驗結束時脂肪層較薄，皮膚蒼白，背部可清晰的看到脊柱棘突。pGCsi-Neu3實驗組體重較對照組相比，精神狀態(tài)尚好，脂肪層相對正常，皮膚較紅潤，惡病質征象不明顯。IL-6作為炎性刺激因子，在多種腫瘤中高表達，與惡病質、晚期腫瘤階段和存活率相關[19-20]。本研究下調Neu3，IL-6表達下降。根據以上結果推測，惡病質的發(fā)生可能與腫瘤細胞的數(shù)目相關。腫瘤細胞絕對數(shù)越大，攝食供能低于機體所需熱量差值越大。腫瘤細胞分布越廣，越容易從周圍細胞獲取能量。腫瘤的分布主要通過轉移實現(xiàn)。腫瘤細胞轉移早期形成各種偽足，其中侵襲性偽足關注度最高[21]。細胞偽足是腫瘤轉移的重要工具，其運動是一個主動耗能過程[22]。因此，下調Neu3延緩前列腺癌荷瘤小鼠惡病質發(fā)病時間和疾病發(fā)生進展，其可能機制時抑制腫瘤細胞增殖和細胞遷移能力及IL-6的水平實現(xiàn)的。

總之，本研究表明Neu3可改善裸鼠的食欲，延緩惡病質的發(fā)生，其具體分子機制將在下一步深入探討。