李杰，馬曉潔，杜小波，譚榜憲

(1.綿陽市中心醫(yī)院腫瘤科，四川 綿陽 621000；2.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤科，四川 南充 637000)

血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM) 是一種獨立于內(nèi)皮細胞血管生成的全新腫瘤微循環(huán)模式。在缺氧微環(huán)境中，腫瘤細胞表達部分內(nèi)皮細胞表型，模擬內(nèi)皮血管生成途徑形成可以輸送血液的微循環(huán)管道，被稱為VM。過去十年針對VM的研究是腫瘤抗血管生成的熱點領域，關(guān)于VM的形成機制成取得不少成果，其中缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，Hif-1α)、上皮細胞激酶(epithelial cell kinase，EphA2)被認為調(diào)控 VM形成的兩個關(guān)鍵因子。本研究旨在探究VM與 Hif-1α、EphA2之間的關(guān)系，揭示VM形成機制。

1 材料與方法

收集川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院、綿陽市中心醫(yī)院2010年至2014年P(guān)LC患者切除術(shù)后的蠟塊標本161例，所有病例臨床病理資料完整。蠟塊重新切片HE染色，明確分化程度、是否合并肝硬化；免疫組化染色觀察Hif-1α和EphA2的表達。鏡下選取5個不重疊的腫瘤細胞視野進行計數(shù)，根據(jù)陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)進行評分，陽性的細胞數(shù)<5%為0分，5～25%為1分，25～50%為2分，50～75%為3分，>75%為4分；染色強弱程度計分，無色：0分；淺黃色：1分；深黃及棕紅色：2分；棕褐色：3分。然后將染色強度×陽性細胞百分比對應的評分作為評分參考，0～3分為(-)；4分為(+)；5～8分為(++)；9～12分為(+++)，將≥4分者記為陽性。VM通過CD31-PAS雙染進行標記，管壁細胞CD31染色陰性且管壁外附PAS陽性的細胞外基質(zhì)，管腔內(nèi)有紅細胞為VM陽性。另外選取15例正常肝組織作為對照組，將正常肝臟組織進行CD31-PAS雙染。

統(tǒng)計分析采用SPSS 23.0軟件進行分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，Logistic回歸模型進行多因素分析，相關(guān)性檢驗采用Spearman相關(guān)分析。雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PLC中VM表達與各臨床因素的關(guān)系

PLC中VM陽性率為37.9%，正常肝臟組織中沒有VM表達。患者不同年齡、性別、病理類型和HbsAg對VM表達比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。VM表達與腫瘤體積(>5 cm3或<5 cm3)呈正相關(guān)(χ2=4.590，P=0.032)；與臨床分期I-II和III-IV(AJCC/UICC第7版)呈正相關(guān)(χ2=5.022，P=0.025)；與HCC edmondson分級呈正相關(guān)(χ2=7.575，P=0.006)；與肝硬化呈正相關(guān)(χ2=8.284，P=0.004)。多因素回歸分析提示臨床分期、肝硬化是影響VM表達的獨立危險因素(P=0.020,P=0.012) 。見圖1、表1和表2。

表1 PLC中VM表達與各臨床因素的關(guān)系

臨床因素nVM (%)陽性陰性P值組別0.001 PLC組16162(38.5)99(61.5) 對照組15015(100.0)性別0.768 男性12247(38.5)75(61.5) 女性3914(35.9)25(64.1)年齡0.773 <60歲11444(38.6)70(61.4) ≥60歲4717(36.2)30(63.8)HBsAg0.865 陰性9937(37.4)62(62.6) 陽性6224(38.7)38(61.3)肝硬化0.004 無11636(31.0)80(69.0) 有4525(55.6)20(44.4)病理類型0.337 肝細胞肝癌13850(36.2)88(63.8) 膽管細胞癌156(40.0)9(60.0) 混合型肝癌85(62.5)3(37.5)臨床分期0.025 Ⅲ-Ⅳ期10446(44.2)58(55.8) Ⅰ-Ⅱ期5715(26.3)42(73.7)edmondson分級0.006 Ⅲ-Ⅳ級8137(45.7)44(54.3) Ⅰ-Ⅱ級5713(22.8)44(77.2)腫瘤體積0.032 <5cm35916(27.1)43(72.) ≥5cm310245(44.1)59(55.9)

表2 Logistic回歸模型進行多因素分析

2.2 Hif-1α和EphA2蛋白的表達

Hif-1α和EphA2蛋白主要在胞漿中表達，鏡下可見呈巢團狀分布，染色后呈棕黃色(圖2)。VM陽性組Hif-1α和EphA2陽性表達率分別為75.4%和80.3%，VM陰性組Hif-1α和EphA2陽性表達率分別為60.0%和63.0%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.608，χ2=8.490；P=0.014，P=0.037)(表3)。Spearman法相關(guān)性分析顯示EphA2與Hif-1α在PLC中的表達存在顯著相關(guān)性(r=0.194，P=0.014)(表4)。

表3 VM表達與EphA2、Hif-1α的關(guān)系

表4 EPHA2與Hif-1α相關(guān)性分析

VariablesEphA2-++++++r值P值Hif-1α-2319112+1414216++1010116+++28220.1940.014

3 討論

原發(fā)性肝癌包括肝細胞癌、肝內(nèi)膽管上皮細胞癌以及兩者混合發(fā)生三種病理類型，根據(jù)2015年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，世界范圍內(nèi)，肝癌致死率在所有惡性腫瘤中排名因第二[1]，是公認的嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一。中國作為肝癌高發(fā)區(qū)，每年約有40萬人死于肝癌，病死率排在我國惡性腫瘤致死原因第二位[2]。PLC治療效果差是其高死亡率的主要原因，越來越多的研究者著力于探索新的治療手段，近年來抗腫瘤血管生成靶向治療成為了研究熱點，研究者對抗腫瘤學血管生成治療的領域進行了廣泛的探索，研發(fā)出多種抗血管生成治療的分子靶向藥物，如貝伐單抗、索拉非尼、阿帕替尼、恩度等藥物廣泛運用于臨床，但肝癌患者的總體療效未得到顯著改善。研究發(fā)現(xiàn)，惡性程度較高的侵襲性腫瘤[3-5]，除了經(jīng)典的內(nèi)皮細胞依賴性血管生成途徑以外，腫瘤細胞可以模擬內(nèi)皮細胞表型形成網(wǎng)狀管道樣結(jié)構(gòu)并與內(nèi)皮依賴性血管相連而成的新生血管,這種血管形成途徑完全不依賴內(nèi)皮細胞，被稱為血管生成擬態(tài)(VM)。VM由腫瘤細胞直接構(gòu)成血管管壁，可為腫瘤的血性轉(zhuǎn)移提供更為便捷的途徑。因此探索VM的形成機制成為必要，以VM為靶標的治療策略成為近年抗血管生成治療研究的重點[6-7]。

15例正常肝臟組織進行CD31-PAS雙染，沒有觀察到VM表達。PLC的三種病理類型，VM總陽性率為38.5%。其中非肝細胞癌23例，VM陽性率40%以上，肝細胞癌VM陽性率36.2%。本研究中不同病理類型VM的表達，差異無統(tǒng)計學意義，由于非肝細胞肝癌樣本量少，不足以說明不同病理類型VM表達的是否存在差異，有待進一步研究證實。

研究表明缺氧微環(huán)境中Hif-1α的過表達是調(diào)控VM形成的重要因素[8]，而EphA2則是VM形成過程中重要的起始調(diào)節(jié)物[9]。本研究結(jié)果還證實了EphA2在Hif-1a高表達區(qū)呈強陽性,且與Hif-1a呈顯著正相關(guān)，腫瘤形成VM的能力顯著增加。研究表明RNA干擾抑制Hif-1a基因在食管鱗癌細胞中的表達,可在一定程度上降低EphA2的表達,抑制VM的形成[10]。調(diào)控機制可能是伴隨著腫瘤體積逐漸增大，腫瘤組織缺血缺氧，缺氧微環(huán)境誘導Hif-1表達增強，調(diào)節(jié)EphA2等基因的活性促進血管生成。一些可塑性強的腫瘤細胞分化和表達內(nèi)皮細胞表型并模擬內(nèi)皮血管結(jié)構(gòu)形成VM,與正常血管連通,共同為腫瘤細胞生長提供營養(yǎng)，腫瘤組織重新獲得血氧供應。在本研究當中，腫瘤體積越大、腫瘤分期越晚VM陽性率越高，恰恰應證這種調(diào)控機制。腫瘤體積增大、臨床分期增加，腫瘤組織內(nèi)部部分區(qū)域血供不足，出現(xiàn)缺血缺氧，缺氧微環(huán)境誘導VM的形成。此外，本研究中肝硬化能增強Hif-1α的表達，提示肝細胞癌合并肝硬化可加重低氧微環(huán)境的形成,其原因可能與肝細胞結(jié)節(jié)性增生、肝癌小梁細胞層增多和纖維結(jié)締組織過度增殖有關(guān)。因此不難理解，合并肝硬化的腫瘤組織中VM表達更強。

在多數(shù)實體瘤中，VM的形成改變了腫瘤局部微環(huán)境，增加了對腫瘤局部浸潤、微轉(zhuǎn)移的途徑，從而影響腫瘤患者的預后。本課題組前期回顧性研究發(fā)現(xiàn)證實VM表達陽性是原發(fā)性肝癌患者PLC預后不良的獨立因素[11-12]。本文主要討論VM的調(diào)控機制，關(guān)于VM對患者預后的影響需要更多的干預性研究來進一步說明。腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，離不開血液的供應，血液供應需要新生血管形成，而血管形成是一個多因素，多靶點的調(diào)控過程，VM的發(fā)現(xiàn)使研究者對腫瘤血管生成有了更全面的認識。近年的研究發(fā)現(xiàn)IL-6[13]、VE-cadherin[14]、Bcl-2和Twist1[15]在VM的調(diào)控機制中也發(fā)揮著重要的作用，但是目前對VM形成過程中的調(diào)控機制尚未系統(tǒng)的闡明，諸多疑問還需要分子水平的研究進一步回答。本研究選取石蠟標本，可能存在蛋白丟失，對結(jié)果造成影響，下一步將在術(shù)后新鮮肝癌組織進行進一步探索。