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        狐尾藻乙酸乙酯萃取部位總黃酮含量測(cè)定與抗氧化活性研究

        2019-04-09 08:30:30陳春雅毛玉玲李澤寧許益迪潘奇獻(xiàn)徐潤生
        浙江化工 2019年3期
        關(guān)鍵詞:石油醚乙酸乙酯光度

        陳春雅,毛玉玲,李澤寧,許益迪,潘奇獻(xiàn),徐潤生

        (浙江農(nóng)林大學(xué)暨陽學(xué)院,浙江 紹興 311800)

        0 前言

        藻類是一種非常重要的植物資源。分布廣泛,成本低廉。不僅可以改善環(huán)境,而且廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、功能材料、合成工業(yè)等領(lǐng)域[1]。已有文獻(xiàn)報(bào)道目前用于食用的淡水藻類幾乎都具有一定的藥用價(jià)值。從藻類植物中提取的黃酮類物質(zhì)又稱生物類黃酮,泛指兩個(gè)苯環(huán)(A-環(huán)和B-環(huán))通過中央三碳鍵相互連接而成的一系列C6-C3-C6化合物。主要是指以2-苯基色原酮為母核的化合物。天然的生物類黃酮多為其基本結(jié)構(gòu)的衍生物,多以糖苷形式存在。有防血栓、保護(hù)心腦血管作用,抗腫瘤、消炎抑菌;解除醇中毒、保肝護(hù)肝;清熱解毒、祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨;調(diào)節(jié)免疫力等作用[2]。藻類資源的開發(fā)利用具有前瞻性的意義。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

        本次研究所用試劑均為分析純。

        儀器:UV-2000紫外可見分光光度,AL104電子天平。

        1.2 提取與濃縮

        取干燥狐尾藻340 g,剪碎,用95%的乙醇提取三次,料液比為1∶9。將提取液進(jìn)行減壓抽濾。通過真空減壓濃縮裝置,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到8.2 g的墨綠色的浸膏。

        浸膏在超聲波作用下分散到適量的水中,用沸程60℃~90℃石油醚進(jìn)行反復(fù)萃取,到石油醚層溶液顏色近為無色為止。合并石油醚萃取液,濃縮后得石油醚部位。

        石油醚萃取后的水相用乙酸乙酯萃取,有機(jī)萃取液與水相體積比為3∶1,至乙酸乙酯層溶液顏色近為無色為止。合并乙酸乙酯萃取液,濃縮后得乙酸乙酯部位浸膏6.2 g。

        1.3 分離

        乙酸乙酯萃取部位,旋蒸成干粉。進(jìn)行硅膠(200~300目)柱色譜分離,采用濕法裝柱。以石油醚、乙酸乙酯按極性遞增進(jìn)行梯度洗脫。每100 mL收集一份,通過TLC檢識(shí),合并相同流分。

        1.4 總黃酮定性鑒別

        通過鹽酸鎂粉反應(yīng)定性檢測(cè)是否含有黃酮類化合物,采用1-萘酚試劑檢測(cè)是否含有黃酮苷。觀察樣品溶液變色情況,觀察1-萘酚反應(yīng)結(jié)果是否為陽性。

        1.5 總黃酮含量測(cè)定

        本次實(shí)驗(yàn)總黃酮含量的測(cè)定采用Al(NO3)3-Na(NO)-NaOH比色法,在510 nm處進(jìn)行吸光度值測(cè)定。此法利用顯色反應(yīng)可避開其他成分的干擾。以蘆丁作對(duì)照品通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制測(cè)得總黃酮含量。

        (1)精密稱取0.0017 g蘆丁對(duì)照品,用70%的乙醇將其進(jìn)行溶解,并且使用10 mL容量瓶對(duì)其進(jìn)行定容,配制成為0.17 mg·mL-1濃度的對(duì)照品溶液。

        (2)精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 0 mL、0.5 mL、1.5 mL、2.5 mL、3.5 mL、4.5 mL 于 10 mL 容量瓶中,分別加入5 mL的70%乙醇溶液,再加入1 mL的5%亞硝酸鈉溶液,搖勻后靜置6 min,然后加入 1 mL的10%硝酸鋁溶液,搖勻后放置6 min,最后加入3 mL的4%氫氧化鈉溶液,用70%乙醇定容至10 mL,搖勻后靜置15 min。把沒有添加任何標(biāo)準(zhǔn)液的試管作為空白對(duì)照,依照上述方法進(jìn)行配置,取潔凈的比色皿將上述試液倒入,并且在510 nm波長處測(cè)定其吸光度值。以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo),以對(duì)照品溶液濃度c(mg·mL-1)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        (3)取黃酮類化合物浸膏,用電子天平稱取2.000 g,再分別用70%的乙醇浸泡在錐形瓶內(nèi),并吸取一定量的樣品溶液于10 ml錐形瓶中,按上述方法于510 nm處測(cè)定樣品吸光度值重復(fù)三次,按標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算出各個(gè)樣品的總黃酮含量取平均值。總黃酮含量用蘆丁當(dāng)量RE(Rutin equivalent)表示。

        1.6 抗氧化活性的測(cè)定

        1.6.1 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

        圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

        稱取一定量的DPPH,用無水乙醇配制成0.004 mg/mL的DPPH溶液。分別取2 mL不同濃度的樣品溶液,加入2 mL DPPH溶液,混合均勻,室溫放置30 min后,5000 r/min離心10 min。取上清液于517 nm處測(cè)吸光值。用Ve作為陽性對(duì)照。

        1.6.2 測(cè)定活性物質(zhì)對(duì)羥自由基的清除率

        采用Fenton試劑[3]:過氧化氫/亞鐵鹽。H2O2與亞鐵離子反應(yīng)生成·OH自由基一般存活時(shí)間比較短,具有較高的反應(yīng)活性。當(dāng)在反應(yīng)體系中添加水楊酸,便能快速地捕捉·OH而產(chǎn)生紫色化合物(2,3-二羥基苯甲酸,該有色化合物在510 nm處有較大吸收峰,測(cè)其吸光度可表示羥自由基(·OH)的多少,吸光度與羥白由基(·OH)的量成正比。反應(yīng)體系中若加入羥自由基(·OH)清除劑后,被氧化的水楊酸減少則體系顏色變淺甚至消失,吸光度變小。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 總黃酮定性鑒別結(jié)果

        通過鹽酸-鎂粉定性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)樣品溶液即刻變成橙紅色,α-1萘酚實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示為陽性,說明有樣品中含有黃酮類化合物。

        2.2 總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

        按照樣品總黃酮含量測(cè)定方法對(duì)樣品吸光度值進(jìn)行測(cè)定,記錄數(shù)值。

        含量計(jì)算方程如下所示:

        測(cè)試結(jié)果如表1。

        表1 總黃酮含量

        由上述數(shù)據(jù)可知狐尾藻乙酸乙酯部位總黃酮含量較高,具有很好的開發(fā)價(jià)值。目前的研究認(rèn)為紫外輻射、高光強(qiáng)、低溫、干旱、營養(yǎng)缺乏、高濃度CO2等因素均可能促進(jìn)黃酮的合成[4],通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn),獲得黃酮含量較高的狐尾藻具有十分重要的意義。

        2.3 抗氧化活性分析

        2.3.1 DPPH抗氧化活性分析

        DPPH自由基在517 nm波長附近有最大吸收峰,當(dāng) DPPH自由基與抗氧化劑反應(yīng)后,517 nm波長處的吸收值 降低,其降低的程度與接收的電子(抗氧化劑清除自由基活性)呈定量關(guān)系,反應(yīng)進(jìn)程很容易通過分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)。DPPH自由基清除計(jì)算公式一般為:

        計(jì)算結(jié)果如表2所示。

        表2 DPPH清除率

        由表2數(shù)據(jù)可知,在一定濃度范圍時(shí)(0.01~0.2 mg/mL),樣品顯示出比對(duì)照品Ve更好的抗氧化效果。

        2.3.2 羥基自由基抗氧化活性分析

        羥基自由基清除率所用公式如下:

        表3 樣品清除·OH自由基效果

        由以上數(shù)據(jù)可知:濃度在0~0.2 mg/mL時(shí),樣品具有較好的清除效果,即具有較好的抗氧化活性。

        2.4 討論

        狐尾藻乙酸乙酯部位中具有較高的總黃酮含量,在DPPH抗氧化活性分析及羥基自由基抗氧化活性分析結(jié)果中均體現(xiàn)出良好的清除自由基能力,即良好的抗氧化效果。

        許多重要生命現(xiàn)象和疾病都與自由基有著直接或間接關(guān)系[5]。狐尾藻作為一種資源豐富,繁殖力強(qiáng)的植物,在治理污水、改善水域環(huán)境等方面具有良好的作用,而從另一個(gè)角度觀察,其本身所具有的開發(fā)價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止如此,它所蘊(yùn)含的有機(jī)物潛力是巨大的,對(duì)其開發(fā)利用在多種領(lǐng)域具有十分重要的意義。我們不僅發(fā)現(xiàn)和拓寬了它的市場(chǎng)價(jià)值,也為以后的科學(xué)研究提供基礎(chǔ)。

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