熊暢，韓毅,2△，郭政,2

急性心肌梗死早期可出現(xiàn)嚴(yán)重的室性心律失常，是引起心源性猝死的重要原因［1］。在此過(guò)程中交感神經(jīng)激活并釋放大量?jī)翰璺影罚?］，而心臟感覺(jué)神經(jīng)同樣被激活釋放多種神經(jīng)肽，包括降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）、P 物質(zhì)（substance P，SP）以及孤啡肽（nociceptin/orphanin FQ，N/OFQ）［3-4］。這提示兩種神經(jīng)系統(tǒng)可能共同參與調(diào)節(jié)急性心肌梗死后的病理過(guò)程。研究表明，激動(dòng)β-腎上腺素能受體通路具有致心律失常特性，而激動(dòng)α-腎上腺素能受體通路具有抗心律失常作用［5］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)拮抗內(nèi)源性N/OFQ能夠抑制缺血性心律失常的發(fā)生［6］，但其具體調(diào)節(jié)途徑尚不清楚。本研究旨在探討內(nèi)源性N/OFQ導(dǎo)致缺血性心律失常與β 腎上腺素能受體通路的關(guān)系，進(jìn)一步探討交感神經(jīng)與心臟感覺(jué)神經(jīng)在急性心肌缺血早期的相互作用。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。SPF 級(jí)健康成年雄性SD 大鼠60只，購(gòu)自解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCHK（京）2014-0013，6～8周齡，體質(zhì)量250～280 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。（2）實(shí)驗(yàn)試劑。孤啡肽受體拮抗劑UFP-101（英國(guó)Tocris Cookson 公司）；膜蛋白提取試劑盒（美國(guó)Invent公司）；兔抗大鼠β1-AR、Na/K-ATPase、GAPDH 一抗以及羊抗兔HRP-IgG 二抗（英國(guó)Abcam 公司）、總RNA 提取試劑盒（9767）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A）以及擴(kuò)增試劑盒（RR820A）均購(gòu)于日本Takara公司。（3）實(shí)驗(yàn)儀器。AlC-V8小動(dòng)物呼吸機(jī)（上海澳爾科特公司）；RM6240BD 電生理信號(hào)記錄儀（成都儀器廠）；MX3005P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（上海拜力生物科技有限公司）；ChemiDoc XRS凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司）；分光光度計(jì)（UV-2800H，上海尤尼柯公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組（n=20）：假手術(shù)組（Sham 組）、結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支（冠脈）組（CAO 組）和孤啡肽受體拮抗劑（UFP-101）預(yù)處理組（U+CAO組），每組在冠脈結(jié)扎后15 min和1 h各處死10只取缺血區(qū)心肌，故每組按照時(shí)間點(diǎn)又分為2個(gè)亞組，共6個(gè)亞組。Sham組僅開(kāi)胸穿線但不結(jié)扎冠脈；CAO 組開(kāi)胸后結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支；U+CAO 組在結(jié)扎冠脈前10 min 經(jīng)尾靜脈按1 mL/kg 注射特異性孤啡肽受體拮抗劑UFP-101（1×10-9mol/L），其余2組給予等容量生理鹽水。

1.2.2 建立大鼠急性心肌缺血模型 大鼠稱質(zhì)量后以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的烏拉坦（1.2 g/kg）進(jìn)行腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥位固定于操作臺(tái)上連接生物信號(hào)采集系統(tǒng)記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。氣管切開(kāi)置入氣管導(dǎo)管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)施行機(jī)械通氣，呼吸機(jī)潮氣量設(shè)為8 mL/kg，呼吸頻率70 次/min。穩(wěn)定15 min 后，按1 mL/kg 經(jīng)尾靜脈分別注入生理鹽水或UFP-101。10 min 后在左側(cè)第四肋間隙開(kāi)胸，以5-0 無(wú)損傷縫線的彎針從左心耳右緣進(jìn)針，肺動(dòng)脈圓錐左緣出針結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。而后可見(jiàn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖出現(xiàn)ST段逐漸抬高并漸與QRS 波融合，心肌前壁組織變蒼白色隨后出現(xiàn)紫紺，可有心律失常出現(xiàn)，提示造模成功。

1.2.3 大鼠心律失常評(píng)分 根據(jù)參考文獻(xiàn)［7］進(jìn)行心律失常評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，冠脈結(jié)扎后1 h內(nèi)共出現(xiàn)＜50個(gè)室早（ventricular ectopic beats，VEB），包括單發(fā)室早、室早二聯(lián)律、室早三聯(lián)律。1分，出現(xiàn)≥50個(gè)VEB。2分，出現(xiàn)1～5次室速（ventricular tachycardia，VT）。3分，出現(xiàn)≥6次VT。4分，出現(xiàn)1次室顫（ventricular fibrillation，VF）。5分，出現(xiàn)2～5次VF。

1.2.4 細(xì)胞膜以及全細(xì)胞β1-AR 蛋白含量測(cè)定 利用膜蛋白提取試劑盒處理提取組織膜蛋白，加入裂解液，分裝后于-80 ℃保存。另外，稱取部分組織按正常步驟提取總蛋白，分裝后于-80 ℃保存。將分裝蛋白利用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，依次進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉2 h 后，加入β1-AR 一抗（稀釋度為1∶1 000）搖勻后4 ℃孵育，搖床過(guò)夜，加入二抗室溫孵育1 h。TBST 清洗，3 次×10 min。應(yīng)用Quantity One 圖像分析軟件測(cè)定各蛋白條帶的灰度值。細(xì)胞膜組分中，以β1-AR條帶灰度值與內(nèi)參Na/K-ATPase灰度值的比值反映其表達(dá)水平；全細(xì)胞組分中，以β1-AR條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值反映其表達(dá)水平。

1.2.5 β1 mRNA表達(dá)測(cè)定 稱取20～30 mg組織提取總RNA，通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定并評(píng)估總RNA純度，然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列取自NCBI Nucleotide Database數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)Primer軟件設(shè)計(jì)與檢驗(yàn)，由Takara生物有限公司合成。β1-AR上游引物5′-CTGCTACAACGACCCCAAGTG-3′，下游引物5′-AACACCCGCAGGTACACGAA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度120 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度452 bp。將合成的cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性60 s；95 ℃變性20 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法對(duì)目的基因進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。非正態(tài)分布計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，組內(nèi)兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，并對(duì)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α′按Bonferroni法進(jìn)行校正。

2 結(jié)果

2.1 模型建立情況 實(shí)驗(yàn)過(guò)程出現(xiàn)缺血性心律失常只做記錄不予抗心律失常處理，本實(shí)驗(yàn)Sham組和U+CAO 大鼠全部存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，CAO 組1只大鼠未到實(shí)驗(yàn)結(jié)束便死于室顫，將其剔除并重新補(bǔ)充標(biāo)本。大鼠心肌缺血前后不同時(shí)間點(diǎn)心電圖變化如圖，見(jiàn)圖1。

Fig.1 Changes of ECG at different time points before and after coronary artery occlusion in rats圖1 大鼠心肌缺血前后不同時(shí)間點(diǎn)心電圖變化

2.2 心肌缺血后室性心律失常的時(shí)間分布 Sham組大鼠心肌穿線后可出現(xiàn)單發(fā)VEB，無(wú)VT、VF 發(fā)生。CAO 組和U+CAO 組大鼠CAO 后均出現(xiàn)缺血性心律失常，且心律失常發(fā)生集中于缺血后15 min 內(nèi)并在15 min 左右達(dá)到高峰，30 min 后無(wú)心律失常出現(xiàn)。CAO 組大鼠缺血1 h 內(nèi)心律失常的時(shí)間分布情況見(jiàn)表1。

Tab.1 Temporal distribution of arrhythmias in CAO group within 1 hour of ischemia表1 CAO組大鼠缺血1 h內(nèi)心律失常的時(shí)間分布（n=10）

2.3 各組大鼠缺血性心律失常的比較 與Sham 組比較，U+CAO 組和CAO 組均出現(xiàn)缺血性心電圖改變，VEB次數(shù)、VT+VF 發(fā)作次數(shù)、持續(xù)時(shí)間及心律失常評(píng)分明顯上升（P＜0.05 或P＜0.017）。與CAO 組比較，U+CAO 組VEB 次數(shù)、VT+VF 持續(xù)時(shí)間及心律失常評(píng)分明顯下降（P＜0.05 或P＜0.017），而VT+VF的發(fā)生次數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

Tab.2 Comparison of cumulative arrhythmias within 1 hour after CAO in three groups of rats表2 3組大鼠冠脈閉塞后1 h內(nèi)累計(jì)心律失常的比較（n=10）

2.4 β1-AR 蛋白及mRNA 的表達(dá) 15 min 時(shí)，與Sham 組比較，CAO 組全細(xì)胞β1-AR 表達(dá)下調(diào)，而細(xì)胞膜β1-AR 上調(diào)，β1-AR mRNA 表達(dá)下調(diào)（均P＜0.05），U+CAO 組全細(xì)胞β1-AR、β1-AR mRNA 表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而細(xì)胞膜β1-AR 下調(diào)（P＜0.05）；與CAO 組比較，U+CAO 組全細(xì)胞β1-AR 表達(dá)上調(diào)，而細(xì)胞膜β1-AR 下調(diào)，β1-AR mRNA表達(dá)上調(diào)（均P＜0.05），見(jiàn)圖2，表3。1 h時(shí)，與Sham組比較，CAO 組和U+CAO 組全細(xì)胞β1-AR 表達(dá)上調(diào)，而細(xì)胞膜β1-AR 下調(diào)，β1-AR mRNA 表達(dá)上調(diào)（均P＜0.05），見(jiàn)圖3，表4。

Fig.2 Expression of β1-AR in plasma membrane and whole cell detected by Western blot assay at 15 min after coronary artery occlusion in three groups of rats圖2 CAO后15 min Western blot檢測(cè)各組β1-AR在細(xì)胞膜和全細(xì)胞的表達(dá)

Tab.3 Comparison of relative expressions of β1-AR and its mRNA at 15 min after coronary artery occlusion between three groups of rats表3 3組大鼠CAO后15 min β1-AR蛋白及其mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較（n=10，）

Tab.3 Comparison of relative expressions of β1-AR and its mRNA at 15 min after coronary artery occlusion between three groups of rats表3 3組大鼠CAO后15 min β1-AR蛋白及其mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較（n=10，）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與U+CAO組比較，P＜0.05

組別Sham組U+CAO組CAO組F細(xì)胞膜β1-AR 0.763±0.049 0.676±0.060a 0.877±0.033ab 40.776＊＊全細(xì)胞β1-AR 0.128±0.004 0.133±0.012 0.106±0.009ab 27.926＊＊β1-AR mRNA 1.014±0.034 1.054±0.060 0.785±0.025ab 101.199＊＊

Fig.3 Expressions of β1-AR in membrane and whole cell detected by Western-blot assay at 1 h after coronary artery occlusion in three groups of rats圖3 CAO后1 h Western-blot檢測(cè)各組β1-AR在細(xì)胞膜和全細(xì)胞的表達(dá)

3 討論

急性心肌梗死可引起心臟交感神經(jīng)末梢兒茶酚胺的釋放急劇增多，在最初的10～15 min，缺血區(qū)心肌兒茶酚胺含量可達(dá)正常組織的100～1 000 倍［8］。此外，早期研究發(fā)現(xiàn)急性心肌缺血導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜上β受體增多（主要是β1受體），而其確切機(jī)制尚不完全清楚［9］。二者共同導(dǎo)致β腎上腺素能受體信號(hào)通路過(guò)度激活，介導(dǎo)缺血性心律失常的發(fā)生。一般認(rèn)為，β 受體過(guò)度激活使得心肌細(xì)胞發(fā)生電生理改變，包括細(xì)胞內(nèi)鈣超載、細(xì)胞外鉀積聚、傳導(dǎo)減慢以及動(dòng)作電位時(shí)程縮短等。目前循證醫(yī)學(xué)證據(jù)亦表明β受體阻滯劑的應(yīng)用可明顯降低心肌梗死引起的心律失常，且是唯一降低病死率的藥物［10-11］。

Tab.4 Comparison of relative expressions of β1-AR and its mRNA at 1 h after coronary artery occlusion between three groups of rats表4 3組大鼠CAO后1 h β1-AR蛋白及其mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較 （n=10，）

Tab.4 Comparison of relative expressions of β1-AR and its mRNA at 1 h after coronary artery occlusion between three groups of rats表4 3組大鼠CAO后1 h β1-AR蛋白及其mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較 （n=10，）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，P＜0.05

組別Sham組U+CAO組CAO組F細(xì)胞膜β1-AR 0.672±0.046 0.372±0.036a 0.352±0.037a 200.930＊＊全細(xì)胞β1-AR 0.089±0.006 0.142±0.003a 0.140±0.010a 217.504＊＊β1-AR mRNA 0.991±0.023 1.241±0.068a 1.212±0.064a 53.449＊＊

N/OFQ同CGRP、SP等一樣，是感覺(jué)神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)肽。N/OFQ及其受體廣泛存在于全身各器官系統(tǒng)，對(duì)于心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)等均有調(diào)節(jié)作用［12］。近年有研究發(fā)現(xiàn)急性心肌缺血時(shí)心肌、脊髓和胸段背根神經(jīng)節(jié)N/OFQ 表達(dá)上調(diào)［4,12］，這些均提示N/OFQ參與心臟病理過(guò)程調(diào)節(jié)。本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)拮抗內(nèi)源性N/OFQ能夠減少缺血性心律失常發(fā)生，并確定其作用呈現(xiàn)劑量相關(guān)性［6］。本次研究根據(jù)前期結(jié)果選擇UFP-101 最佳劑量（10-9mol/L，1 mL/kg）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

既往研究顯示大鼠冠脈結(jié)扎后1 h內(nèi)，心律失常出現(xiàn)在前30 min內(nèi)［13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明心律失常集中在前15 min 內(nèi)并于15 min 左右達(dá)到峰值。通過(guò)對(duì)比冠脈結(jié)扎后15 min 和1 h 2個(gè)時(shí)間點(diǎn)β1受體在全細(xì)胞以及細(xì)胞膜的變化情況，發(fā)現(xiàn)β1受體在急性心肌缺血早期呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程。與假手術(shù)組相比，缺血后15 min，β1受體顯著外化，而全細(xì)胞β1受體及其mRNA下降，此時(shí)伴隨室性心律失常的頻繁發(fā)生；缺血后1 h，β1 受體出現(xiàn)內(nèi)化，而全細(xì)胞β1受體及其mRNA增多，表現(xiàn)出少心律失常甚至無(wú)心律失常發(fā)生。當(dāng)給予特異性孤啡肽受體拮抗劑拮抗內(nèi)源性N/OFQ以后，出現(xiàn)室性心律失常的降低，與此同時(shí)，膜β1 受體顯著下降。提示β1 受體在細(xì)胞膜的表達(dá)增多可能導(dǎo)致缺血性心律失常的發(fā)生，而拮抗內(nèi)源性N/OFQ可通過(guò)下調(diào)急性心肌缺血早期心肌細(xì)胞膜β1 受體進(jìn)而降低缺血性心律失常。另外，膜β1 受體與全細(xì)胞β1 受體的轉(zhuǎn)錄翻譯呈現(xiàn)相反趨勢(shì)，其機(jī)制尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)比較3組大鼠室性心律失常發(fā)生的時(shí)間分布以及相應(yīng)時(shí)點(diǎn)β1 受體在心肌細(xì)胞的變化情況，揭示了急性心肌缺血早期（15 min）β1 受體在心肌細(xì)胞膜表達(dá)上調(diào)是導(dǎo)致缺血性心律失常的關(guān)鍵因素，而內(nèi)源性N/OFQ 是介導(dǎo)急性心肌缺血早期心肌細(xì)胞膜β1 受體上調(diào)的因素之一。然而關(guān)于心肌缺血1 h 時(shí)細(xì)胞膜β1 受體下調(diào)的原因尚不清楚，推測(cè)有更多的機(jī)體自我保護(hù)機(jī)制參與其中調(diào)節(jié)。此外，目前關(guān)于感覺(jué)神經(jīng)肽對(duì)于心血管系統(tǒng)的調(diào)控，主要以保護(hù)作用為主［14］。最近的研究表明，心臟CGRP 的保留能夠減輕糖尿病大鼠心功能不全的發(fā)生［15-16］，SP通過(guò)抑制急性心肌梗死后PKA活性調(diào)節(jié)心功能［17］，甚至發(fā)揮抗心律失常作用［18］。而本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性N/OFQ作用于外周通過(guò)上調(diào)心肌細(xì)胞膜β1受體展現(xiàn)出的致心律失常作用，是感覺(jué)神經(jīng)對(duì)于心血管系統(tǒng)雙重調(diào)控的重要補(bǔ)充。綜上所述，內(nèi)源性N/OFQ 可通過(guò)β1 腎上腺素能受體通路調(diào)節(jié)大鼠缺血性心律失常的發(fā)生。