莫昆

（云南省文山州動物疫病預(yù)防控制中心 663000）

1 背景及目的意義

高致病性禽流感是由A型流行性感冒病毒引起的一種禽類（家禽和野禽）傳染病，可以直接感染人類，并造成死亡。至今發(fā)現(xiàn)能直接感染人的禽流感病毒亞型有：H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2和H7N9亞型。其中，高致病性禽流感H5N1亞型和2013年3月在人體上首次發(fā)現(xiàn)的新禽流感H7N9亞型尤為引人關(guān)注，不僅造成人類傷亡，同時(shí)重創(chuàng)了家禽養(yǎng)殖業(yè)。2017年6月，云南省文山州首次出現(xiàn)了4例人感染高致病性禽流感H7N9亞型病例，導(dǎo)致全州人民群眾生命財(cái)產(chǎn)安全和公共衛(wèi)生安全受到嚴(yán)重威脅，同時(shí)也造成社會的恐慌和家禽養(yǎng)殖業(yè)的重大損失，2017年全州存欄家禽1404.4萬羽，大部分是以千家萬戶散養(yǎng)為主的生產(chǎn)方式，普遍存在養(yǎng)殖設(shè)備簡陋、技術(shù)落后等問題，不具備科學(xué)防控禽流感的預(yù)警能力，一旦發(fā)生疫病極易造成流行和蔓延，從而引發(fā)重大的經(jīng)濟(jì)損失和人群危害。再者，文山州地處邊疆，與越南邊境線長達(dá)438km，境外疫情復(fù)雜而且高發(fā)，境外疫病傳入風(fēng)險(xiǎn)較高，針對文山州高致病性禽流感防控的嚴(yán)峻形勢，文山州動物疫病預(yù)防控制中心在云南省動物疫病預(yù)防控制中心及文山州農(nóng)業(yè)局的領(lǐng)導(dǎo)和支持下，開展了文山州高致病性禽流感監(jiān)測預(yù)警模式的研究，以努力確保不發(fā)生區(qū)域性重大動物疫病和不發(fā)生重大畜產(chǎn)品安全事件為目標(biāo)，圍繞建立和提高全州禽流感科學(xué)防控預(yù)警能力，提高邊境沿線防疫屏障的疫情防堵能力為核心任務(wù)，以實(shí)現(xiàn)“防風(fēng)險(xiǎn)、保安全、促發(fā)展”為總體目標(biāo)任務(wù)。項(xiàng)目主要實(shí)施在全州邊境地區(qū)、養(yǎng)殖密集區(qū)、老疫區(qū)、候鳥遷徙或棲息地等高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)，依托具備資質(zhì)的縣級獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室5個(gè)，設(shè)立禽流感疫情監(jiān)測網(wǎng)點(diǎn)52個(gè)，引進(jìn)分子生物學(xué)檢驗(yàn)新技術(shù)，配備相關(guān)設(shè)備，建立文山州第一個(gè)禽流感等疫病的病原學(xué)監(jiān)測預(yù)警的分子生物學(xué)檢測（PCR）實(shí)驗(yàn)室，承擔(dān)全州疫情監(jiān)測、上報(bào)、流行病學(xué)分析等關(guān)鍵技術(shù)，構(gòu)建了文山州禽流感監(jiān)測預(yù)警體系，并成功控制和處置了2017年H7N9亞型流感疫情。

2 實(shí)施的內(nèi)容

（1）分子生物學(xué)檢測室的建設(shè)。

（2）建立高致病性禽流感分子生物學(xué)檢測方法（以下簡稱PCR檢測）。

（3）設(shè)置監(jiān)測點(diǎn)，建設(shè)高致病性禽流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)。

（4）構(gòu)建高致病性禽流感監(jiān)測預(yù)警模式。

（5）運(yùn)用監(jiān)測預(yù)警模式開展高致病性禽流感監(jiān)測預(yù)警。

3 項(xiàng)目實(shí)施的技術(shù)路線、方法步驟及保障措施

3.1 技術(shù)路線

3.2 方法步驟

3.2.1 PCR檢測室的建設(shè)

2016年起，為提高動物疫病防控能力，文山州動物疫病預(yù)防控制中心積極籌措資金進(jìn)行PCR檢測室的建設(shè)。

3.2.2 設(shè)置監(jiān)測點(diǎn)，確立監(jiān)測方案

根據(jù)HACCP危害分析和關(guān)鍵控制點(diǎn)原理，結(jié)合文山州實(shí)際，科學(xué)設(shè)置文山州高致病性禽流感監(jiān)測點(diǎn)，并制定監(jiān)測方案。

3.2.3 建立高致病性禽流感PCR檢測方法

PCR檢測技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。檢測步驟包括病毒核酸提取、PCR擴(kuò)增、凝膠電泳、成像。

（1）樣品采集：把采集的咽喉、泄殖腔、環(huán)境、運(yùn)輸工具棉拭子分裝在盛有保存液的2ml離心管中密封，認(rèn)真填寫采樣表，于采樣后20d內(nèi)派專人專車運(yùn)送至獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室。

（2）病毒核酸提取，采用AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒。①收集200μl樣品，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中；②加200μl Buffer V-L（病毒裂解液），漩渦振蕩混合均勻，靜置5分鐘；③加75μl Buffer V-N（蛋白去除液），漩渦振蕩混合均勻，12000×g離心5min；④將上清轉(zhuǎn)移到新的2ml離心管中，加300μl異丙醇（1%冰乙酸），上下倒置6～8次，混合均勻；⑤將制備管置于2ml離心管中，取步驟④中的混合液移入制備管中，6000×g離心1min；⑥棄濾液，將制備管置回到2ml離心管中，加500μl Buffer W1A（洗滌液），室溫靜置1min，12000×g離心1min；⑦棄濾液，將制備管置回到2ml離心管中，加800μl Buffer W2（去鹽液），12000×g離心1min；⑧將制備管置回到2ml離心管中，12000×g離心1min；⑨將制備管置于潔凈的1.5ml離心管中，在制備管膜中央加40～60μl Buffer TE,室溫靜置1min，12000×g離心1min洗脫DNA/RNA。

（3）PCR擴(kuò)增，引物由云南省動物疫病預(yù)防控制中心提供。

凝膠電泳。①凝膠制作：將1.2g西班牙瓊脂糖加入120ml 1×TAE電泳緩沖液中，搖勻，在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解，加入6μl花青素（體外染色劑），待瓊脂糖溶液冷卻至60℃左右將其倒入事先準(zhǔn)備好的膠板中，室溫冷卻凝固，完全凝固后將凝膠置入電泳槽中，加入1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1～2mm，小心垂直向上拔出梳子；②上樣：用移液器吸取8μl擴(kuò)增產(chǎn)物與6×loading buffer混勻后小心加入凝膠中的點(diǎn)樣孔，吸取3μl Marker 2000加入另一點(diǎn)樣孔；③電泳：打開電泳儀開關(guān)，由于DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場的作用下將向正極移動，電泳約20～35min。

成像：將電泳后的凝膠置于凝膠成像儀，觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.2.4 構(gòu)建高致病性禽流感監(jiān)測預(yù)警模式

以監(jiān)測點(diǎn)為基礎(chǔ)，依托PCR檢測室，運(yùn)用樣品采集、PCR檢測、免疫抗體檢測、流行病學(xué)調(diào)查等方法，認(rèn)真開展高致病性禽流感監(jiān)測，及時(shí)分析文山州高致病性禽流感分布規(guī)律，建立科學(xué)有效、切合文山州實(shí)際的高致病性禽流感監(jiān)測預(yù)警模式。

3.2.5 開展高致病性禽流感PCR檢測

每月開展一次活禽交易市場高致病性禽流感A型檢測工作。檢測出的陽性樣品派出專人專車送省動物疫病預(yù)防控制中心確認(rèn)并定型。

3.2.6 開展高致病性禽流感免疫抗體檢測

為準(zhǔn)確評估高致病性禽流感免疫效果發(fā)現(xiàn)，高致病性禽流感免疫薄弱點(diǎn)，及時(shí)排除疫情隱患，采用定期和緊急兩種方式進(jìn)行高致病性禽流感免疫抗體檢測，定期檢測采用集中檢測和常規(guī)檢測相結(jié)合的方法開展檢測，集中檢測每年開展2次，主要對文山州春、秋兩防免疫效果進(jìn)行評估，常規(guī)檢測每月開展1次，主要對規(guī)模養(yǎng)殖場的免疫效果進(jìn)行評估，緊急檢測主要為處置疑似高致病性禽流感疫情提供科學(xué)依據(jù)。

3.2.7 開展流行病學(xué)調(diào)查

通過調(diào)查禽流感在文山州的分布及危害程度來制定切合文山州實(shí)際的科學(xué)有效的防控措施。在人口密集、規(guī)模養(yǎng)殖集中的文山市和邊境通道多，邊民互市活躍的麻栗坡縣、富寧縣的重點(diǎn)區(qū)域，選擇規(guī)模養(yǎng)殖場和活禽交易市場進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和采集樣品，通過定期、連續(xù)采集調(diào)查點(diǎn)中的相關(guān)數(shù)據(jù)，為疫情分析評估提供信息。

3.2.8 分析文山州高致病性禽流感分布規(guī)律

根據(jù)長期檢測結(jié)果分析，文山州家禽所感染的高致病性禽流感亞型，以及各種亞型在時(shí)間、空間的分布規(guī)律。

3.3 保障措施

3.3.1 成立課題實(shí)施小組

為保證項(xiàng)目順利完成，成立了項(xiàng)目實(shí)施小組，討論制定實(shí)施方案和技術(shù)路線，關(guān)鍵技術(shù)研究，各環(huán)節(jié)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)、經(jīng)費(fèi)使用、進(jìn)度安排等。

3.3.2 經(jīng)費(fèi)保證

為保障項(xiàng)目的順利實(shí)施，共籌措180萬元資金投入該項(xiàng)目。

4 項(xiàng)目實(shí)施結(jié)果

4.1 建成一個(gè)PCR檢測室

PCR檢測室于2017年9月建成并投入使用。PCR檢測室內(nèi)設(shè)試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)4個(gè)功能區(qū)，配備梯度PCR儀、電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、臺式多功能離心機(jī)、生物安全柜等24臺套儀器設(shè)備，可開展禽流感、雞新城疫等病毒核酸檢測。

4.2 設(shè)立52個(gè)監(jiān)測點(diǎn)

結(jié)合文山州實(shí)際，設(shè)置了以文山市城區(qū)活禽交易市場為主、各縣城區(qū)活禽交易市場為輔、兼顧規(guī)模養(yǎng)殖場的監(jiān)測點(diǎn)，目前，文山州共設(shè)立52個(gè)監(jiān)測點(diǎn)。

4.3 完成高致病性禽流感PCR檢測方法的建立工作

2017年8月，由云南省省動物疫病預(yù)防控制中心提供盲樣，并派出技術(shù)人員到現(xiàn)場指導(dǎo)，經(jīng)省、州技術(shù)人員多次試驗(yàn)驗(yàn)證，最終建立了適合文山州動物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室PCR檢測室實(shí)際的高致病性禽流感PCR檢測方法，確保了檢測的準(zhǔn)確性、可靠性。

4.4 建立了科學(xué)的高致病性禽流感監(jiān)測預(yù)警模式

（1）是將集中監(jiān)測和常規(guī)監(jiān)測相結(jié)合、常規(guī)監(jiān)測與應(yīng)急監(jiān)測相結(jié)合、抗體監(jiān)測和病原監(jiān)測相結(jié)合、實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測與流行病學(xué)調(diào)查相結(jié)合，認(rèn)真分析、評估疫情發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)測疫情流行態(tài)勢，及時(shí)獲得疫情預(yù)警信息。

（2）是突出加強(qiáng)對邊境地區(qū)、州府所在地、縣市城區(qū)所在地、養(yǎng)殖密集區(qū)的監(jiān)測，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和掌握重大動物疫情隱患，嚴(yán)格疫情報(bào)告和診斷。

（3）是增加監(jiān)測比例、加大監(jiān)測力度，及時(shí)匯總分析監(jiān)測結(jié)果，全面評估發(fā)生疫情的風(fēng)險(xiǎn)，力求準(zhǔn)確預(yù)測疫情發(fā)生和流行的態(tài)勢，科學(xué)指導(dǎo)防控工作。

4.5 高致病性禽流感監(jiān)測預(yù)警模式的應(yīng)用

4.5.1 定期開展監(jiān)測與流行病調(diào)查

實(shí)驗(yàn)室于2017年9月開始每月進(jìn)行1次流感病原學(xué)檢測，并對檢測出高致性禽流感病原學(xué)陽性的監(jiān)測場點(diǎn)開展流行病學(xué)調(diào)查。至2018年3月，共檢測禽流感病原學(xué)樣品4901份，檢出A型禽流感陽性樣品279份，檢出的陽性樣品經(jīng)省級獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測確認(rèn)，共有A型陽性248份，其中H5亞型8份。8份H5亞型流感涉及到文山、丘北兩個(gè)縣市的6個(gè)活禽交易市場，經(jīng)調(diào)查未發(fā)現(xiàn)存在臨床癥狀的病禽。

2017年在文山州104個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)、638個(gè)村、1104個(gè)場戶開展了高致病性禽流感免疫效果定期檢測，抽檢了10414羽份血清樣品，合格8111份,合格率為77.89%，達(dá)到了群體免疫合格。

4.5.2 緊急開展監(jiān)測與流行病學(xué)調(diào)查

2018年1月23日至2月4日，馬關(guān)縣動物疫病預(yù)防控制中心于在馬白鎮(zhèn)下寨村委會壩尾村進(jìn)行禽流感流行病學(xué)調(diào)查采樣時(shí)，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)雞戶田立寧家養(yǎng)殖場的雞發(fā)病快、死亡率高情況，經(jīng)采樣送省、州進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果為禽流感H5N6陽性。為準(zhǔn)確評估馬關(guān)縣馬白鎮(zhèn)高致病性禽流感免疫效果，文山州動物疫病預(yù)防控制中心派出專業(yè)技術(shù)人員，在馬關(guān)縣動物疫病預(yù)防控制中心緊急開展免疫抗體檢測，H5亞型免疫抗體檢測共檢測禽血清128份，合格69份（抗體效價(jià)5log2以上），合格率53.9%；H7亞型免疫抗體檢測共檢測禽血清120份，合格48份（抗體效價(jià)5log2以上），合格率40%。

表2 高致病性禽流感病原學(xué)檢測情況

圖1 文山州禽流感病原時(shí)間分布情況

圖2 文山州禽流感病原空間分布情況

4.5.3 初步分析出文山州高致病性禽流感的分布、流行規(guī)律

時(shí)間分布情況：從圖1中可以看出，文山州家禽間禽流感病原感染以低致病性禽流感H9N2亞型為主，2017年9月至2018年1月期間未檢測出高致病性禽流感陽性禽，2018年2月、3月分別檢測出1份、7份高致病性禽流感H5N1陽性禽，可分析出高致病性禽流感H5N1亞型在文山州有感染率上升的趨勢。

從圖2中可以看出，文山州家禽間禽流感病原感染主要分布于文山市、西疇縣、麻栗坡縣、丘北縣、廣南縣，其中以文山市家禽間帶毒率最高。

根據(jù)2017年9月到2018年3月的監(jiān)測與調(diào)查結(jié)果分析，文山州禽流感病原感染以低致病性H9亞型流感為主，H9亞型流感每個(gè)月均有檢出，從區(qū)域上看，H9亞型流感主要分布在文山市、西疇縣、麻栗坡縣、丘北縣、廣南縣，污染面達(dá)到62.5%；2017年9月到12月文山州未檢測出高致病性禽流感陽性禽，2017年9月到2018年3月文山州均未檢測出H7亞型流感陽性禽，2018年1月到3月均檢出高致病性H5亞型流感陽性禽，從區(qū)域上看，H5亞型流感主要分布在文山市、丘北縣、馬頭縣，污染面達(dá)到37.5%。

4.5.4 及時(shí)上報(bào)監(jiān)測預(yù)警報(bào)告

2017年9月到2018年3月，根據(jù)高致性禽流感的監(jiān)測結(jié)果，向州農(nóng)業(yè)局提供禽流感疫情監(jiān)測預(yù)警報(bào)告4份，并指導(dǎo)各縣及時(shí)處置高致性禽流感病原學(xué)檢測陽性禽及其同群禽。

4.5.5 為科學(xué)防控高致病性禽流感提供保障

在文山州8縣推廣應(yīng)用快速、敏感的高致病性禽流感的抗體監(jiān)測方法，擴(kuò)大了監(jiān)測范圍的深度和廣度。各縣均能監(jiān)測禽免疫后的免疫效果，根據(jù)免疫效果實(shí)施科學(xué)防控對策；并能及時(shí)掌握疫情動態(tài)，一旦發(fā)現(xiàn)疫情，盡早檢測做出準(zhǔn)確診斷，嚴(yán)格實(shí)施有效防控措施，防止疫情擴(kuò)散傳播，為當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖業(yè)發(fā)展提供技術(shù)保障。通過開展病原學(xué)PCR檢測，及時(shí)發(fā)現(xiàn)感染高致病性禽流感的家禽，發(fā)出監(jiān)測預(yù)警，提出防控建議，為上級主管部門、各縣市做好疫情處置提供快速準(zhǔn)確的防控依據(jù)。

5 創(chuàng)新點(diǎn)

5.1 文山州禽流感監(jiān)測首次拓展到環(huán)境樣品

項(xiàng)目實(shí)施前，文山州的動物疫病監(jiān)測樣品以血清為主，不能監(jiān)測組織樣品和環(huán)境樣品，實(shí)施該項(xiàng)目后，文山州可以開展組織樣品和環(huán)境樣品的監(jiān)測，填補(bǔ)了因畜禽死亡無法采集血清導(dǎo)致的監(jiān)測工作開展不了的空白，進(jìn)一步完善了文山州動物疫病監(jiān)測體系。

5.2 文山州禽流感監(jiān)測方法首次從血清學(xué)拓展到病原學(xué)檢測

血清學(xué)檢測過程中會經(jīng)常出現(xiàn)假陽性反應(yīng)、降低檢測的靈敏度、制備抗血清的時(shí)間較長且利用該方法一次只能檢測一種病毒。病原學(xué)檢測具有特異性高、靈敏度高、快速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，通常一次可以檢測多種病毒。文山州高致病性禽流感PCR檢測方法的建立和應(yīng)用，監(jiān)測方法由血清學(xué)轉(zhuǎn)變?yōu)椴≡瓕W(xué)，確保了疫情的準(zhǔn)確快速監(jiān)測。

6 效益分析

6.1 經(jīng)濟(jì)效益

（1）建立快速、敏感的高致病性禽流感病PCR檢測方法，降低監(jiān)測成本，達(dá)到同類診斷生物制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，監(jiān)測成本降低50%。每年節(jié)約開支約20萬元左右。

（2）揭示高致病性禽流感病在文山州的傳染源及分布規(guī)律，建立實(shí)時(shí)、動態(tài)、有效的高致病性禽流感病監(jiān)測預(yù)警，由于防控及時(shí)，降低了高致病性禽流感疫情發(fā)生概率。大大減少疫情發(fā)生而造成的經(jīng)濟(jì)損失，以及撲滅疫情所投入的大量人力、財(cái)力、物力等支出，以文山州首次出現(xiàn)了4例人感染H7N9亞型流感病例為例，2017年6月，文山州因發(fā)生H7N9亞型流感疫情導(dǎo)致?lián)錃㈥栃约巴呵?2903羽，按現(xiàn)行價(jià)50元/只計(jì)算，養(yǎng)殖戶損失1645150元（32903×50），因市場關(guān)閉、禁止活禽移動，導(dǎo)致165.95萬羽活禽推遲上市1個(gè)月（2017年文山州出欄禽1991.44萬羽，平均月出欄165.95萬羽），按每天每羽禽平均增加飼養(yǎng)成本0.2元計(jì)算，養(yǎng)殖戶損失995.7萬元，以上兩項(xiàng)共計(jì)讓養(yǎng)殖戶損失1160.22萬元。

（3）由于常規(guī)養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)會產(chǎn)生一定的畜禽死亡率，按降低死亡率2%計(jì)算，每年可減少家禽死亡28.01萬羽，減少經(jīng)濟(jì)損失1400.50萬元。 （按2017年家禽存欄統(tǒng)計(jì)數(shù)1404.4萬羽，以現(xiàn)行價(jià)50元/羽計(jì)算）。

以上3項(xiàng)合計(jì)共2580.7萬元。

6.2 社會效益

（1）此項(xiàng)目的實(shí)施，為文山州防控禽流感提供病原學(xué)依據(jù)和有效的技術(shù)支撐，同時(shí)為其他重大動物疫病的監(jiān)測預(yù)警提供借鑒和參照模式，提高了文山州防控重大動物疫病的整體實(shí)力和技術(shù)水平，促進(jìn)畜牧業(yè)持續(xù)健康發(fā)展，保障公共衛(wèi)生安全。

（2）通過項(xiàng)目的實(shí)施，開展流行病學(xué)調(diào)查、疫病監(jiān)測、試驗(yàn)示范、技術(shù)培訓(xùn)等工作整體提高了獸醫(yī)隊(duì)伍業(yè)務(wù)素質(zhì)和技能。