汪白云 劉國良 樸成玉 陳巧云 陳景華 薛慧 劉斌

[摘要] 目的 預(yù)測發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯防治阿爾茨海默病（AD）的作用靶標(biāo)，探討多成分-多靶點(diǎn)-多通路的協(xié)同作用機(jī)制。 方法 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法針對補(bǔ)陽還五湯的方劑組成，采用多元網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測補(bǔ)陽還五湯的體內(nèi)作用靶標(biāo)，通過BATMAN-TCM等數(shù)據(jù)庫對比補(bǔ)陽還五湯抗AD藥物靶標(biāo)，最終采用Cytoscape軟件構(gòu)建補(bǔ)陽還五湯成分-靶點(diǎn)-通路的網(wǎng)絡(luò)。 結(jié)果 補(bǔ)陽還五湯中活性成分涉及多個(gè)與AD直接相關(guān)的體內(nèi)靶標(biāo)，如載脂蛋白E（APOE）等。同時(shí)涉及多個(gè)代謝通路，如甘油磷脂代謝、膽堿能突觸、膽固醇代謝、AD通路等。 結(jié)論 補(bǔ)陽還五湯主要通過多成分協(xié)同起效，如1-十六碳烯對載脂蛋白E調(diào)節(jié)間接起到調(diào)控疏水性淀粉樣β（Aβ）沉淀形成、藏花醛對乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶的抑制作用等，進(jìn)而延緩AD的發(fā)生發(fā)展。

[關(guān)鍵詞] 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);補(bǔ)陽還五湯;阿爾茨海默病;靶點(diǎn);載脂蛋白E

[中圖分類號(hào)] R749? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）02（c）-0012-04

[Abstract] Objective To predict and discover the target of Buyang Huanwu Decoction in the prevention and treatment of Alzheimer′s disease （AD） and explore the synergistic mechanism of multi-component， multi-target and multi-pathway. Methods According to the composition of Buyang Huanwu Decoction， the in vivo target of Buyang Huanwu Decoction was predicted by multiple network pharmacology methods. The target of anti-AD drug was selected by BATMAN-TCM and other databases. Finally， the components of Buyang Huanwu Decoction were constructed by Cycaptose software for target path network. Results The active components of Buyang Huanwu Decoction were involved in many targets directly related to Alzheimer′s disease， such as apolipoprotein E （APOE）. At the same time， it involves many metabolic pathways， such as glycerol phospholipid metabolism， cholinergic synapses， cholesterol metabolism， Alzheimer′s disease pathway and so on. Conclusion Buyang Huanwu Decoction mainly works through multi-component synergy， such as 1-hexadecence regulates apoliporotein E indirectly to regulate the formation of hydrophobic amyloid β （Aβ）， the inhibition of safranal on acetylcholinesterase and butyrocholinesterase， thus delaying the occurrence and development of AD.

[Key words] Network pharmacology; Buyang Huanwu Decoction; Alzheimer′s disease; Target; Apolipoprotein E

阿爾茨海默?。ˋD）是一種極大影響患者、家庭的重大社會(huì)問題[1-6]。常規(guī)的臨床診斷大多采用通過咨詢患者病史和認(rèn)知能力測試，但這些方法具有較低的敏感性和特異性，并只有在患者死亡后通過解剖發(fā)現(xiàn)疾病過程的物理證據(jù)時(shí)，才有可能作出明確的診斷。然而，當(dāng)患者的體征和癥狀可以明確診斷時(shí)，其腦病理學(xué)往往相當(dāng)嚴(yán)重，這極大地影響和延誤了患者的病情及康復(fù)。目前，針對AD的治療藥物很多，但大多有明顯的毒副作用，如現(xiàn)階段唯一獲準(zhǔn)用于AD主要治療藥物的乙酰膽堿酯酶抑制劑（ACHEⅠ），不適用于心動(dòng)過緩及低血壓患者。因此，治療AD的有效和副作用小的藥物亟待發(fā)現(xiàn)。

中醫(yī)理論認(rèn)為，氣為血之帥，血為氣之母，治風(fēng)先治血，血行風(fēng)自滅。氣虛血瘀是缺血性腦血管病發(fā)生的主要病機(jī)，外感邪氣或臟腑功能失調(diào)，氣血運(yùn)巧不暢。血不達(dá)于腦，正氣虧虛，氣虛推動(dòng)無力，產(chǎn)生血疲，兩者互為因果，病情纏綿難愈。益氣活血的代表方劑補(bǔ)陽還五湯在臨床作為防治缺血性中風(fēng)重要藥物，一直被廣泛應(yīng)用。但明確的基于補(bǔ)陽還五湯治療缺血性中風(fēng)的體內(nèi)作用靶標(biāo)及機(jī)制尚不可知，本實(shí)驗(yàn)采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從方劑所含成分入手，根據(jù)藥物分子的理論對接靶標(biāo)預(yù)測補(bǔ)陽還五湯的直接作用成分，為實(shí)驗(yàn)研究和臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

TCMID中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)（http：//www.megabionet.org/tcmid/）;BATMAN-TCM平臺(tái)（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）;ChemBioOffice 2014綜合性科學(xué)應(yīng)用軟件包（CambridgeSoft公司，美國），PharmMapper反向藥效團(tuán)匹配數(shù)據(jù)庫（http：//lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/index.php）;STRING 10.5功能蛋白的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）;UniProt蛋白質(zhì)生物功能數(shù)據(jù)庫（http：//www.Uniprot.org/）;Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes京都基因與基因組百科全書（http：//www.Genome.jp/kegg/）;DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）;MAS 3.0生物分子功能注釋系統(tǒng)（http：//mas.capitalbiotech.com/mas3/）;Cytoscape 3.5.1數(shù)據(jù)可視化軟件（http：//cytoscape.org/）。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建補(bǔ)陽還五湯化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫? 通過TCMID數(shù)據(jù)庫和美國國家醫(yī)學(xué)圖書館PubMed數(shù)據(jù)庫檢索補(bǔ)陽還五湯中所含化學(xué)成分[7-13]，特別是口服補(bǔ)陽還五湯后入血成分[14]，構(gòu)建補(bǔ)陽還五湯所含化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。

1.2.2 靶點(diǎn)預(yù)測及篩選? 基于補(bǔ)陽還五湯的化學(xué)成分，BATMAN-TCM數(shù)據(jù)平臺(tái)對補(bǔ)陽還五湯所含化學(xué)成分進(jìn)行化合物-作用靶標(biāo)預(yù)測，并設(shè)定閾值收錄分子對接打分最高的前10個(gè)靶點(diǎn)用于下一步靶點(diǎn)及藥物作用網(wǎng)絡(luò)分析;將補(bǔ)陽還五湯中所含的143個(gè)化學(xué)成分全部帶入ChemBioOffice 2014軟件，用于生成具有化學(xué)物3D結(jié)構(gòu)的mol2文件，并將其分別帶入PharmMapper反向藥效團(tuán)匹配數(shù)據(jù)庫，根據(jù)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測與其對接不同程度的作用靶點(diǎn);同時(shí)將上述143個(gè)化合物帶入STRING 10.5功能蛋白的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫預(yù)測藥物靶點(diǎn)。最后將上述結(jié)果進(jìn)行匯總?cè)枯斎氲鞍踪|(zhì)生物功能數(shù)據(jù)庫（UniProt），將其校正為官方名稱。

1.2.3 通路獲取及生物機(jī)制分析? 將獲取的所有靶點(diǎn)編號(hào)帶入MAS 3.0數(shù)據(jù)庫，通過對基因、mRNA、蛋白、通路、協(xié)同調(diào)節(jié)基因、疾病、相互作用、miRNA等多方面綜合分析，最終獲取關(guān)于補(bǔ)陽還五湯關(guān)于作用靶點(diǎn)的整合數(shù)據(jù)。

1.2.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及補(bǔ)陽還五湯防治AD的作用機(jī)制分析? 將上述初篩靶標(biāo)帶入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能和通路富集，選擇P < 0.05，且與AD相關(guān)的基因本體術(shù)語（Gene ontology term）、KEGG通路（KEGG pathway）、孟德爾人類遺傳/治療靶數(shù)據(jù)庫（OMIM/TTD disease）。富集并聚焦核心通路及靶點(diǎn)。最終通過Cytoscape 3.5.1軟件的Network Analyzer插件分析及構(gòu)建靶點(diǎn)的代謝網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)陽還五湯所含化學(xué)成分結(jié)果

通過TCMSP及BATMAN-TCM數(shù)據(jù)平臺(tái)及文獻(xiàn)檢索整合獲取補(bǔ)陽還五湯中160個(gè)化合物，其中與預(yù)防AD密切相關(guān)的成分有16個(gè)，分別是香芹酚、1-十六碳烯、乙酸亞油醇、藏花醛、新辛烯、3-己醇、甜菜堿、苯乙醛、3，5-二甲氧基二苯乙烯、膽堿、1-十七碳烯、2-己醇、丹皮酚、花生酸、乙酸、刀豆氨酸。與AD發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的主要靶標(biāo)有10個(gè)，分別是載脂蛋白E、乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶、緩激肽B2、羧酸酯酶1、煙堿型乙酰膽堿受體B2、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶1、犬尿氨酸酶、神經(jīng)生長因子受體、前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2。見表1。

2.2 補(bǔ)陽還五湯潛在靶點(diǎn)代謝通路結(jié)果

整合上述數(shù)據(jù)處理過程及相關(guān)數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果，匯總補(bǔ)陽還五湯代謝通路結(jié)果。見表2。

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析

最后利用Cytoscape 3.5.1軟件進(jìn)行處理，得到補(bǔ)陽還五湯“結(jié)構(gòu)類型-化合物-蛋白靶點(diǎn)-通路-病理過程”的成分靶標(biāo)互作圖。補(bǔ)陽還五湯中含有的1-十六碳烯、1-十七碳烯和新辛烯。

3 討論

通過對網(wǎng)絡(luò)中各化合物作用通路具體信息分析發(fā)現(xiàn)載脂蛋白E（ApoE）與AD的發(fā)病機(jī)制有密切相關(guān)性[15-20]。ApoE是一種血漿蛋白，由229個(gè)氨基酸組成，與脂肪結(jié)合及膽固醇類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。其主要的合成和分泌場所是肝臟，其次是大腦?，F(xiàn)代研究表明ApoE直接促進(jìn)了疏水性淀粉樣β（Aβ）沉淀的形成?？梢酝ㄟ^加入純化后的ApoE來控制Aβ發(fā)生聚集的相對速度和聚集程度。ApoE多態(tài)性等位基因是AD風(fēng)險(xiǎn)的主要遺傳決定因素：攜帶ε4等位基因的個(gè)體與攜帶較常見ε3等位基因的個(gè)體比較，患AD的風(fēng)險(xiǎn)增加，而ε2等位基因則降低風(fēng)險(xiǎn)。ApoE ε4等位基因的存在還與正常老化期間腦淀粉樣血管病的風(fēng)險(xiǎn)增加和與年齡相關(guān)的認(rèn)知能力下降有關(guān)。載脂蛋白與多種細(xì)胞表面受體結(jié)合，傳遞脂質(zhì)，還與Aβ肽結(jié)合，引發(fā)毒性事件，導(dǎo)致AD的突觸功能障礙和神經(jīng)變性。在大腦中，載脂蛋白在調(diào)節(jié)腦脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、葡萄糖代謝、神經(jīng)元信號(hào)傳導(dǎo)、神經(jīng)炎癥和線粒體功能方面具有明顯的功能。神經(jīng)退行性疾病AD的特征是存在β-淀粉樣蛋白（Aβ）病理和Tau病理。罕見的AD病例由常染色體顯性突變引起，但大多數(shù)患者有散發(fā)性AD。導(dǎo)致散發(fā)性AD的途徑可能是多種多樣的，并且根據(jù)患者是否攜帶載脂蛋白，疾病途徑可能不同。葉黃素ApoE ε4是AD的主要遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子，并且可能促進(jìn)Aβ的積累，觸發(fā)導(dǎo)致Tau病理學(xué)擴(kuò)散、突觸功能障礙、萎縮和認(rèn)知能力下降的級聯(lián)反應(yīng)。30%～40%的散發(fā)性AD癡呆患者是ApoE ε4陰性，這些患者可能主要有非遺忘性認(rèn)知障礙等現(xiàn)象，與ApoE ε4陽性AD患者比較，以往對AD中ApoE ε4的研究由于缺乏對AD診斷的Aβ-生物標(biāo)志物確認(rèn)而受到限制，這使得患者有可能被納入AD的假陽性診斷研究中。目前，關(guān)于ApoE ε4在前驅(qū)性AD中的作用研究較少，無論在臨床實(shí)踐中還是在藥物開發(fā)中，前驅(qū)性AD都是一個(gè)日益重要的疾病階段。因此如何靶向性的針對ApoE來設(shè)計(jì)是治療AD的有效策略。

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（收稿日期：2018-10-06? 本文編輯：封? ?華）