蘇云娟，陳鐵紅，卜立敏，申海靜，陳 雪，劉冰洋

作者單位：(110003)中國遼寧省沈陽市，沈陽愛爾眼視光醫(yī)院

0引言

圓錐角膜是一種較為常見的、漸進性的、非炎癥性的雙眼角膜擴張性疾病，角膜由于變薄和突出而呈圓錐形[1]。角膜擴張性疾病導致角膜突出、散光、視力喪失，甚至可能導致穿孔。傳統的治療方法包括框架眼鏡、硬性透氣性角膜接觸鏡(RGPCL)、角膜基質環(huán)植入等，但均無法阻止圓錐角膜進展，約20%患眼最終需進行角膜移植。角膜膠原交聯術(corneal collagen cross-linking，CXL)是利用核黃素(維生素B2)和紫外線A(ultraviolet A，UVA)之間的光氧化反應來增加角膜纖維間的共價鍵，從而增加角膜硬度，延緩甚至阻止角膜膨隆的進展[2]，其是一種相對較新的治療進展性圓錐角膜的方法?；铙w共焦顯微鏡(IVCM)可在細胞層面上對角膜進行活體研究，其提供了與體外組織化學方法相類似的圖像，特別適用于角膜細胞分析[3]。本研究的目的是評價CXL治療后角膜微結構的變化，并利用IVCM分析角膜隨時間的改變情況。

1對象和方法

1.1對象選取2016-02/2017-02于我院行CXL術治療的進展期圓錐角膜患者11例15眼，其中女5例7眼，男6例8眼，平均年齡31.0±14.1歲。納入標準：確診為進展期圓錐角膜，近1a內屈光狀態(tài)增加≥1.00D，或角膜曲率增加≥1.00D，無其它影響視力的眼部疾病，愿意并能夠堅持完成隨訪。排除標準：(1)有可見的角膜瘢痕患者；(2)其它原因引起的角膜瘢痕、皰疹性角膜炎、嚴重干眼、角膜感染等眼部疾病者；(3)自身免疫性疾病者；(4)角膜厚度小于400μm。本研究經過醫(yī)院倫理委員會批準，且符合《赫爾辛基宣言》，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

圖1患者A手術前后角膜基底細胞IVCM圖像(×800)
A：術前，基底細胞大小和形態(tài)較均勻一致；B：術后1mo，基底細胞形態(tài)變異較大；C：術后3mo，基底細胞形態(tài)變異較大；D：術后6mo，基底細胞形態(tài)變異減??；E：術后12mo，基底細胞大小及形態(tài)趨于正常。

圖2不同患者手術前后角膜上皮下神經纖維典型IVCM圖像(×800)
A：術前，可見上皮下神經纖維扭曲、分支多；B：術后1mo，可見上皮下神經纖維呈片段狀改變；C：術后3mo，未發(fā)現明顯神經纖維，前彈力層呈條索狀改變；D：術后6mo，可見明顯的上皮下神經纖維，但較稀疏；E：術后12mo，可見神經纖維，但仍然較稀疏。

1.2方法

1.2.1手術方法術前所有患者均進行最佳矯正視力、裂隙燈、電腦驗光、眼壓、淚液分泌試驗、角膜地形圖、共焦顯微鏡等檢查，排除手術禁忌證。術前眼表面麻醉2～3次，開瞼器開瞼，將角膜環(huán)放置于鞏膜表面，用9.0mm環(huán)鉆以角膜中央為中心刻痕，刮除此范圍的角膜上皮組織。向角膜滴1滴1g/L核黃素，使完全覆蓋角膜表面，至少2min一次，持續(xù)10min。大量無菌生理鹽水沖洗干凈。對準角膜區(qū)域，照射紫外線(總能量7.2J/cm2∶30mW/cm2)4min。照射結束后，配戴繃帶型角膜接觸鏡至角膜上皮完全愈合。術后術眼使用妥布霉素地塞米松眼膏涂眼。

1.2.2IVCM檢查所有患者分別于術前和術后1、3、6、12mo進行IVCM(HRT3)檢查，激光波長670nm，放大倍率為800倍，水平分辨率為1μm，垂直分辨率為1μm，觀察視野400μm×400μm角膜的面積。檢查方法：待檢眼用5g/L鹽酸丙美卡因滴眼液進行表面麻醉3次，在顯微鏡頭的前表面點1滴卡波姆滴眼液，將一次性無菌角膜接觸帽蓋于物鏡上，使接觸帽內表面與物鏡表面通過凝膠相貼附。轉動角膜顯微物鏡，直到屏幕中出現明亮的激光反射，設此時焦點位置的深度為0μm。調整IVCM頜托和前額托的位置，將受檢者的下頜與前額分別固定在下頜托與前額托上，并使受檢眼外眥與檢查標記線對齊。旋轉調鈕前移物鏡，在前進至靠近角膜表面時，調整物鏡位置，使掃描頭對準角膜中心，囑受檢者盡量睜大眼，前移物鏡至角膜接觸帽觸及到受檢者的角膜，通過前后及水平轉動物鏡探頭位置，以獲得不同深度和不同層次的角膜細胞和神經的圖像，IVCM掃描中央3～4mm范圍內角膜，同時踩下按鈕，將圖像進行保存，并選出每層中最清晰的2張圖片。上皮下神經叢圖像定義為Bowman膜層水平第一個清晰的神經叢圖像；前部基質細胞層圖像定義為緊靠Bowman膜層后基質的第一個清晰圖像；后部基質細胞層圖像定義為緊靠內皮層之前基質的第一個清晰圖像。使用Image J軟件分析上皮下神經纖維密度，通過測量每幅圖像中神經的總長度計算上皮下神經纖維密度。使用IVCM自帶分析軟件定量分析內皮細胞密度和基質細胞密度。每次檢查均由經驗豐富的操作者進行。

2結果

2.1 IVCM觀察角膜特點

2.1.1角膜上皮術前，本組患者角膜上皮層(表皮細胞層、翼狀細胞層和基底細胞層)各層細胞大小及形態(tài)均正常。術后1mo可見角膜上皮細胞出現大小異常、形態(tài)不規(guī)則改變，而基底細胞越接近前彈力層方向細胞形態(tài)變異越大，可見片狀無細胞結構區(qū)。術后3mo表皮細胞形態(tài)幾乎接近正常，而基底細胞變異仍較大。術后6mo基底細胞形態(tài)變異減小。術后12mo基底細胞大小及形態(tài)趨于正常(圖1)。

2.1.2角膜上皮下神經叢術前，本組患者角膜上皮下神經表現為極度扭曲和神經纖維分支多。術后1mo，7眼可見上皮下神經片段，8眼未見任何上皮下神經。術后3mo，10眼可見上皮下神經片段，5眼未見任何上皮下神經。術后6mo，12眼可見少量上皮下神經纖維或神經片段，3眼未見任何上皮下神經。術后12mo，15眼均可見上皮下神經纖維或神經片段，但數量仍較少，未恢復到術前水平(圖2)。

圖3患者B手術前后角膜基質IVCM圖像(×800)
圖A～C：術前，可見低反射微條紋的網狀結構；圖D～F：術后1mo，可見角膜前基質呈蜂窩狀或網狀高反射改變，隨著深度的加深，這種結構變化減少，幾乎未見基質細胞核；圖G～I：術后3mo，蜂窩狀或網狀高反射結構變化仍可見，基質細胞核開始出現；圖J～L：術后6mo，蜂窩狀結構明顯減少；圖M～O：術后12mo，基質細胞數量幾乎恢復到術前水平，但前基質仍可見反射增強，細條索狀改變。Z表示掃描深度。

圖4患者C手術前后角膜內皮IVCM圖像(×800)
A：術前；B：術后1mo；C：術后12mo。

2.1.3角膜基質術前，本組患者特征性基質細胞在角膜前、中、后基質中均可見，基質中可見低反射微條紋的網狀結構。CXL術后，角膜基質發(fā)生了顯著變化。術后1mo，角膜基質呈蜂窩狀或網狀高反射結構，幾乎未見典型高反射基質細胞，這種顯著的結構變化在前部和中部基質中可見，隨著深度的加深，這種結構變化減少。術后3mo，上述結構變化仍然可見，僅見少量基質細胞。術后6mo，角膜基質蜂窩狀結構明顯減少，基質細胞數量仍較少。術后12mo，前部基質細胞數量幾乎恢復到術前水平，但前部基質仍可見反射增強，細條索狀改變。術后隨訪觀察后部角膜基質細胞一直未受明顯影響。約1/2病例基質中可見細長針狀結構，隨著隨訪時間的延長，這種改變未見明顯減少(圖3)。

2.1.4角膜內皮手術前后，本組患者角膜內皮細胞大小和形態(tài)均未見明顯變化(圖4)。

2.2手術前后角膜上皮下神經纖維、基質細胞和內皮細胞密度的比較本組患者不同時間點角膜上皮下神經纖維密度比較，差異有統計學意義(F=3.529，P<0.05)，術后1、3、6、12mo角膜上皮下神經纖維密度與術前相比均明顯降低，差異有統計學意義(t=4.092、3.982、2.403、1.540，均P<0.05)。不同時間點角膜前部基質細胞密度比較，差異有統計學意義(F=5.014，P<0.05)，其中術后1、3、6mo角膜前部基質細胞密度與術前相比均降低，差異有統計學意義(t=5.932、6.125、3.431，均P<0.05)，術后12mo角膜前部基質細胞密度與術前相比略降低，但差異無統計學意義(t=0.382，P=0.708)。不同時間點角膜后部基質細胞密度和內皮細胞密度比較，差異均無統計學意義(F=0.707、0.651，均P>0.05)，見表1。

2.3不良反應情況隨訪期間，本組患者均未出現任何與治療相關的不良反應或角膜內皮細胞損傷，IVCM檢查后均未出現角膜并發(fā)癥。

時間上皮下神經纖維(mm/mm2)前部基質細胞(個/mm2)后部基質細胞(個/mm2)內皮細胞(個/mm2)術前19.72±4.61421.8±102.5220.1±37.12701±93.0術后1mo2.23±3.531.2±10.1211.8±47.02700±90.3術后3mo5.39±5.9774.3±51.2221.2±39.82693±74.2術后6mo8.22±6.20209.5±45.9222.6±21.472708±92.6術后12mo12.58±6.17418.9±93.1228.0±42.972698±105.4 F3.5295.0140.7050.651P0.0240.010.4040.970

3討論

利用核黃素和紫外線進行CXL最早是由Spoerl等[4]提出來的，CXL可以增加角膜組織硬度。CXL被認為是唯一一種可以延緩或阻止進展性圓錐角膜發(fā)展的“病理性方法”[5]。本研究中，我們應用IVCM觀察CXL術后角膜各層細胞發(fā)生的變化。之前國內也有關于應用IVCM觀察CXL術后角膜改變的相關報道[6]，本研究主要側重于對CXL術后角膜各層細胞變化的觀察，這在國內相關文獻中鮮有報道。

理論上，在深度超過300μm時紫外線能量及氧自由基均已不足,這樣可以確保CXL對角膜內皮產生的損傷最小[7]。本組患者術后1～12mo隨訪中，角膜內皮細胞形態(tài)及數量均未見明顯改變，這與既往研究結果類似的[8-10]。CXL術中角膜上皮被刮除，故術后常引起疼痛。術后給予配戴繃帶型角膜接觸鏡，疼痛癥狀有所緩解。術后1mo時角膜上皮已經完全愈合，我們行IVCM檢查發(fā)現術后1mo表皮細胞、翼狀細胞、基底細胞出現大小異常、形態(tài)不規(guī)則。隨著隨訪時間的延長，我們發(fā)現這種形態(tài)異常逐漸減小，直到術后3mo，表皮細胞形態(tài)幾乎接近正常，而基底細胞變化較大，越接近前彈力層方向細胞形態(tài)變異越大，可見片狀無細胞結構區(qū)。分析可能與CXL術主要作用于角膜膠原纖維有關，越靠近前彈力層，膠原纖維越密集，故基底細胞損傷越重，但是確切病理機制有待進一步研究。術后12mo基底細胞大小及形態(tài)趨于正常，表明CXL術對角膜上皮的影響是可以恢復的[11]。

本研究發(fā)現，CXL術后1、3、6mo角膜上皮下神經纖維顯著減少或完全消失，直到術后12mo，角膜上皮下神經纖維仍然稀疏，未達到術前水平。本研究結果與Jordan等[8]研究結果相似，該研究選取38例圓錐角膜患者，結果發(fā)現CXL術后1mo時上皮下神經缺損率為71%，術后3mo時為55%，術后6mo時為18%，術后12mo時為7%，相互連接的神經纖維未形成之前表現為片段狀。Knappe等[11]研究發(fā)現，CXL術后4mo時可以檢測到角膜上皮下神經。這與本研究結果略有差別，分析可能與術后隨訪時間不同有關。Alessio等[9]研究發(fā)現，CXL術后18mo角膜上皮下神經纖維逐漸達到術前水平，直到術后4a，趨于穩(wěn)定，這與本研究結果相似。說明上皮下神經的恢復需要更長的時間。研究表明，CXL術后早期階段(2～4wk)中央角膜上皮下神經纖維完全消失[11，12-14]，而在隨后的12～24mo上皮下神經逐漸再生[13-14]。上述變化也說明CXL術后早期角膜敏感性降低。另有研究發(fā)現，CXL術后早期角膜上皮下神經密度降低，這種情況也同樣發(fā)生在準分子激光角膜切削術(PRK)術后[15]。PRK術后4wk上皮下神經纖維開始再生，術后12mo仍未恢復到術前水平，術后24mo恢復到術前水平[16-17]。這與CXL術后上皮下神經再生的過程相似，然而目前還不清楚角膜上皮下神經纖維的缺失是由于角膜上皮損傷和核黃素/UVA治療引起的，還是CXL術后早期角膜水腫IVCM不能觀察到上皮下神經纖維導致[8]。

CXL術后早期最大的變化發(fā)生在基質層，特別是前、中基質層，典型表現為基質細胞消失，取而代之的是蜂窩狀或網狀高反射結構，主要累積于前、中部基質。本研究術后1mo前基質中幾乎未見基質細胞，與Knappe等[11]研究結果相一致。而Mohammad-Naeim等[10]發(fā)現46%患者術后1mo未發(fā)現基質細胞，而54%患者可以發(fā)現少量基質細胞。既往研究表明，CXL術后早期，前部基質呈蜂窩狀水腫，幾乎所有前基質細胞均發(fā)生凋亡，類似于PRK術后[18]。我們研究發(fā)現，術后3mo時可見前基質出現少量基質細胞，與相關研究基本一致，表明CXL術后2～3mo角膜基質細胞開始修復[11-13]。同時我們發(fā)現術后6mo基質細胞數量未恢復到術前水平，并且前部基質仍可見反射增強，細條索狀改變，并且隨著隨訪時間的延長，基質細胞數量逐漸增加，到術后12mo前部基質細胞數量基本達到術前水平，這與Mohammad-Naeim等[10]研究結果一致。Jordan等[8]發(fā)現術后1mo時86%角膜基質細胞完全消失，術后1、3mo可以觀察到散在的基質細胞，術后6mo基質細胞數量明顯增加，術后12mo達到正常水平，這與本研究結果相似。前部基質水腫及基質細胞凋亡是由于上皮層、Bowman層、前部基質層損傷所致，但是目前的體外研究證實，相比單獨使用紫外線引起前部基質細胞凋亡，CXL引起細胞凋亡會更嚴重[13]。

本研究中，CXL術后后基質細胞數量不受影響，這一結論與之前的研究結果一致[11，13-14]。另外，有研究報道，術后1mo時中部基質呈高反射帶，這個區(qū)域內角膜基質細胞變成細長針狀結構，呈高反射，隨著時間的延長，這種結構逐漸消失，術后1a 60%患者存在細長的基質細胞，47%患者存在高反射帶[8]。這些結構被假設為新合成的膠原，可能為活化角膜基質細胞的產物[9，11，13]。Kymionis等[19]注意到這種細長針狀結構在隨訪過程中會發(fā)生從后基質到前基質的移位。最近的體外研究也表明，這種結構與短暫的角膜成纖維細胞生成有關，具有異常上皮基底膜的角膜會產生肌成纖維細胞，形成永久的haze或瘢痕[17，20-21]。

綜上，本研究應用IVCM觀察發(fā)現CXL術后早期角膜上皮下神經纖維顯著減少或消失，前部基質層基質細胞幾乎完全凋亡及基質水腫，后部基質層及內皮細胞層不受累；術后12mo，基質細胞幾乎達到術前水平，而角膜上皮下神經纖維未達到術前水平，還需要更長時間恢復。此外，由于本研究納入樣本過少，故仍需進一步擴大樣本量，延長術后觀察時間，進行更深入的研究。