鄒 波，徐玉娟，肖更生，吳繼軍，余元善，唐道邦，溫 靖

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510610)

駿棗(ZizyphusjujubeMill. Cv. Junzao)是鼠李科棗屬植物，廣泛種植于我國(guó)新疆地區(qū)[1]。研究表明，駿棗具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，富含碳水化合物、礦物質(zhì)、維生素、氨基酸、多酚、多糖等營(yíng)養(yǎng)成分[2-4]，并具有抗氧化、提高免疫力、護(hù)肝等功效[5-7]。

據(jù)報(bào)道，世界上90%的紅棗產(chǎn)于我國(guó)，并且產(chǎn)量逐年上升[8]。新疆是我國(guó)紅棗的主產(chǎn)區(qū)之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年新疆紅棗種植面積49.6萬公頃，產(chǎn)量305萬噸，位居我國(guó)首位[9]。作為新疆主栽品種之一的駿棗，目前主要以鮮食和棗干加工為主，其他形式的加工產(chǎn)品非常少見[8]。研究表明，駿棗的糖含量為60%～80%，加入適當(dāng)?shù)乃趾螅浅＿m合果酒的釀造[10-11]。盡管紅棗發(fā)酵酒的研制已有少量報(bào)道，但多數(shù)棗酒是采用果膠酶解后進(jìn)行發(fā)酵[12]，或者對(duì)紅棗進(jìn)行提汁后發(fā)酵[13]。紅棗果膠含量高，酶解過程中易生成甲醇，質(zhì)量難以控制，與用熱水提取的棗汁發(fā)酵酒相比，酶解提汁的發(fā)酵酒甲醇含量上升了6倍以上[13]，并且直接采用提取汁液發(fā)酵，營(yíng)養(yǎng)損失較大。

有研究表明，釀酒酵母的種類對(duì)果酒的品質(zhì)有重要的影響。紅棗在釀酒酵母的作用下，一方面產(chǎn)生酒精及多種風(fēng)味物質(zhì)，另一方面也可能產(chǎn)生對(duì)果酒品質(zhì)不利的代謝產(chǎn)物，如甲醇、雜醇油等[14-15]。酵母對(duì)果酒品質(zhì)的影響可能與酵母的發(fā)酵特性及紅棗的營(yíng)養(yǎng)成分有關(guān)；此外，酵母發(fā)酵對(duì)紅棗的抗氧化能力等功能也具有一定的影響[6]。目前采用紅棗漿直接進(jìn)行酵母發(fā)酵的研究鮮見報(bào)道，本研究以駿棗漿為原料，利用氣相色譜等分析手段，研究在不同商業(yè)化釀酒酵母的作用下，酒精度、甲醇、雜醇油、抗氧化能力等指標(biāo)在發(fā)酵過程中的變化規(guī)律，以期為駿棗釀酒酵母的篩選提供科學(xué)指導(dǎo)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

駿棗，購(gòu)于新疆喀什；活性干酵母RV002，購(gòu)自安琪酵母股份有限公司；活性干酵母BO213、FX10，購(gòu)于法國(guó)Laffort公司；活性干酵母EC1118，購(gòu)于煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于Sigma-Aldrich公司；正丙醇、異丁醇、異戊醇、4-甲基-2-戊醇(色譜純)標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇(色譜純)，購(gòu)自德國(guó)Meker公司；總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)測(cè)定試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；水為超純水，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GC- 2010Plus型氣相色譜儀(配有AOC- 20i自動(dòng)進(jìn)樣器和氫火焰離子檢測(cè)器(FID))、UV- 1800型分光光度計(jì)，日本島津公司；PB- 10型pH計(jì)，賽多利斯公司；RFM3400型數(shù)顯折光儀，英國(guó)Bellingham+Stanley公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1駿棗果酒發(fā)酵工藝流程

駿棗果酒發(fā)酵工藝流程見圖1。

駿棗清洗→去核→浸泡→打漿→成分調(diào)整→接種→發(fā)酵

圖1 駿棗果酒發(fā)酵工藝流程

Fig.1 Routing of Jun-jujube wine fermentation

1.3.2發(fā)酵操作要點(diǎn)

原料預(yù)處理：駿棗洗凈后去核，用80 ℃水(駿棗與水的比例為1∶4)浸泡1 h，然后打漿。

成分調(diào)整：駿棗漿中添加白砂糖和檸檬酸，最終總可溶性固形物(total soluble solid，TSS)為23°Brix，總酸為5 g/L，添加亞硫酸鈉50 mg/kg。

接種發(fā)酵：酵母活化后加入到棗漿中，活性干酵母的添加量為0.25 g/kg。發(fā)酵溫度控制在(25±1) ℃，發(fā)酵前3 d每天攪拌3次，3 d后停止攪拌。

1.3.3總可溶性固形物、酒精度、pH值、總酸的測(cè)定

分別取發(fā)酵0，2，4，7，10 d的樣品，100目濾布過濾后采用數(shù)顯折光儀測(cè)定TSS含量，pH值用pH計(jì)直接測(cè)定，總酸(total acids，TA)根據(jù)GB/T12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》中酸堿中和滴定法[16]測(cè)定，酒精度的測(cè)定根據(jù)GB5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測(cè)定》中酒精計(jì)法[17]進(jìn)行。

1.3.4甲醇、雜醇油含量的測(cè)定

甲醇、雜醇油含量的測(cè)定：準(zhǔn)確稱取甲醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇、4-甲基-2-戊醇標(biāo)品500 mg，用10%乙醇溶液定容到10 mL，該溶液用于定性分析。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：將甲醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇溶液混合，加入10%乙醇，使各標(biāo)準(zhǔn)品的最終質(zhì)量濃度為50、125、250、500、1 000 mg/L；取不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10 mL，加入0.1 mL 4-甲基-2-戊醇溶液(內(nèi)標(biāo))。

樣品的制備：棗酒在10 000 r/min條件下離心10 min，取上清液10 mL，加入內(nèi)標(biāo)4-甲基-2-戊醇溶液0.1 mL，采用0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行氣相色譜分析。

氣相色譜條件：色譜柱為DB- FFAP聚乙二醇強(qiáng)極性柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；程序升溫模式為起始溫度40 ℃，保持5 min，以3 ℃/min升溫至50 ℃，保持3 min，以8 ℃/min升溫至120 ℃，保持1 min，再以20 ℃/min升溫至240 ℃，保持3 min；檢測(cè)器溫度為250 ℃；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；載氣(N2)流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量1.0 μL；分流比為20∶1。

定量分析采用內(nèi)標(biāo)加入法，以4-甲基-2-戊醇為內(nèi)標(biāo)，以甲醇和各雜醇油峰面積與內(nèi)標(biāo)的比值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品中的甲醇和雜醇油的含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

1.3.5總酚含量的測(cè)定

樣品用5倍體積的HCl-甲醇(體積比為1∶99)超聲提取10 min，然后10 000 r/min離心10 min，收集上清液，沉淀重復(fù)提取1次，合并提取液?？偡雍坎捎肍olin-Ciocalteu法[18]進(jìn)行測(cè)定，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，駿棗酒中總酚含量以沒食子酸當(dāng)量(gallic acid equivalent，GAE)表示。

1.3.6總抗氧化能力的測(cè)定

總抗氧化能力按照總抗氧化能力(T- AOC)測(cè)定試劑盒的方法進(jìn)行。在37 ℃時(shí)，將單位時(shí)間(min)、單位體積(mL)樣品使反應(yīng)體系的吸光值每增加0.01個(gè)總抗氧化能力單位，作為樣品的總抗氧化能力，以U/mL表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3次平行，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin 8.05軟件進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母對(duì)駿棗果酒發(fā)酵過程中TSS、酒精度、pH值和TA的影響

駿棗果酒發(fā)酵過程中TSS、酒精度、pH值和TA的變化結(jié)果如圖2。圖2(a)、(b)中，發(fā)酵前4 d，4種酵母均快速消耗碳水化合物，導(dǎo)致TSS快速下降，其中EC1118和RV002組前4 d的TSS下降速度明顯快于BO213和FX10組；發(fā)酵第4天至第10天，EC1118和RV002組的TSS無明顯變化，而BO213和FX10組呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)。與之對(duì)應(yīng)的，發(fā)酵前4 d，EC1118和RV002組酒精度快速上升，分別從0增加至9.30%和9.6%，10 d后酒精度分別為11.68%和11.89%；而BO213和FX10組發(fā)酵8 d后酒精度增速變緩，10 d后酒精度不再上升，最終酒精度分別穩(wěn)定在11.05%和10.84%，因此后續(xù)的理化指標(biāo)檢測(cè)取樣從0 d到10 d。

圖2(c)和(d)中，pH值略微下降，TA輕微上升，整體變化不明顯。這說明不同種類的釀酒酵母對(duì)駿棗果酒的酸度影響不大。

圖2 駿棗果酒發(fā)酵過程中TSS含量、酒精度、pH值、TA的變化Fig.2 Changes in TSS, alcohol content, pH, and TA of Jun-jujube wine during fermentation

2.2 不同酵母對(duì)駿棗果酒發(fā)酵過程中甲醇和雜醇油的影響

甲醇是果酒中對(duì)人體有害的微量成分。甲醇對(duì)視覺神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有破壞作用，可導(dǎo)致頭暈、失明，甚至死亡[19]。雜醇油是一類碳原子數(shù)超過2的醇類化合物，主要包括正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇等，也叫高級(jí)醇[20]。研究表明，雜醇油較難被人體代謝，在機(jī)體內(nèi)停留時(shí)間較長(zhǎng)，是導(dǎo)致飲酒上頭的主要物質(zhì)[14,20]。駿棗酒中甲醇和雜醇油的氣相色譜如圖3。從圖中可以看出，駿棗酒中含有甲醇、正丙醇、異丁醇和異戊醇。

1.甲醇； 2.乙醇； 3.正丙醇； 4.異丁醇； 5.4-甲基-2-戊醇(內(nèi)標(biāo))； 6.異戊醇。圖3 FX10發(fā)酵的駿棗果酒甲醇和雜醇油的氣相色譜Fig.3 Gas chromatogram of methanol and fusel oil of Jun-jujube wine fermented by FX10

駿棗果酒發(fā)酵過程中甲醇的變化如圖4。發(fā)酵2 d后，甲醇濃度從高到低依次為RV002、EC1118、FX10和BO213；發(fā)酵2～10 d，F(xiàn)X10甲醇含量沒有明顯變化，其他3組均有所下降；發(fā)酵結(jié)束后，以BO213甲醇含量最低，質(zhì)量濃度為7.52 mg/L。本研究與張麗芝[12]、張寶善等[13]的研究有所不同，這可能與原料的前處理工藝不同有關(guān)，前者采用的是酶解后的棗汁進(jìn)行發(fā)酵，后者采用的是熱水浸提的紅棗提取液進(jìn)行發(fā)酵，本研究采用的是紅棗原漿直接進(jìn)行發(fā)酵。紅棗酒中甲醇的來源主要有兩種：一種是果膠水解后產(chǎn)生，這也是最主要的來源；另一種是甘氨酸脫氨基和羧基降解后形成[19]。由于駿棗含有大量的果膠成分，因此控制棗酒中甲醇的含量尤為重要。不同的釀酒酵母對(duì)果膠及甘氨酸的分解能力有所差異，本研究結(jié)果表明，酒精發(fā)酵速度快時(shí)，棗酒中甲醇含量相對(duì)也高一些，這與前人報(bào)道的結(jié)果一致[12]。

圖5 駿棗果酒發(fā)酵過程中雜醇油含量的變化Fig.5 Changes in fusel oil contents of Jun-jujube wine during fermentation

圖4 駿棗果酒發(fā)酵過程中甲醇含量的變化Fig.4 Changes in methanol contents of Jun-jujube wine during fermentation

駿棗果酒發(fā)酵過程中雜醇油含量的變化情況如圖5。圖5(a)中，發(fā)酵過程中正丙醇濃度均呈先增加后降低的趨勢(shì)，發(fā)酵結(jié)束后，以EC1118組正丙醇濃度最高，其次是RV002組，兩者的正丙醇質(zhì)量濃度均超過200 mg/L；相對(duì)而言，BO213組和FX10組正丙醇質(zhì)量濃度較低，分別為53.57 mg/L和90.30 mg/L。圖5(b)中，F(xiàn)X10組異丁醇的變化最大，發(fā)酵前7 d快速上升，10 d后升至60.10 mg/L，其他3組變化較小，其中以BO213組變化最小，發(fā)酵10 d后異丁醇的質(zhì)量濃度為12.70 mg/L。圖5(c)中，發(fā)酵過程中異戊醇的變化與異丁醇的變化趨勢(shì)類似，發(fā)酵10 d后，F(xiàn)X10組異戊醇質(zhì)量濃度最高，為950.00 mg/L；BO213組質(zhì)量濃度最低，為202.33 mg/L。圖5(d)中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，雜醇油呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，發(fā)酵10 d后，雜醇油的質(zhì)量濃度從高到低依次為FX10、EC1118、RV002、BO213(268.6 mg/L)。

雜醇油是酵母果酒發(fā)酵過程中的副產(chǎn)物，主要來源于氨基酸代謝和糖代謝[14]。眾多研究表明，酵母的種類對(duì)雜醇油的生成影響較大[10,15,21]。王宓等[21]研究了6種酵母對(duì)紅棗白蘭地原料酒雜醇油的影響，發(fā)現(xiàn)不同酵母菌發(fā)酵的紅棗白蘭地，雜醇油的含量存在明顯差異，以安琪耐高溫釀酒高活性干酵母產(chǎn)生的雜醇油含量最低。張麗芝[12]研究了3種酵母對(duì)發(fā)酵棗酒中雜醇油的影響，結(jié)果表明，采用實(shí)驗(yàn)室分離的葡萄酒酵母菌發(fā)酵的紅棗酒，雜醇油含量最低。Aragon等[22]的研究也表明，酵母的種類對(duì)雜醇油的生成影響較大。

2.3 不同酵母對(duì)駿棗果酒發(fā)酵過程中總酚和抗氧化能力的影響

駿棗果酒發(fā)酵過程中總酚的變化如圖6。整個(gè)發(fā)酵過程中，總酚含量沒有明顯的變化，不同組別之間差異不大。發(fā)酵10 d后總酚質(zhì)量濃度為1.50～1.56 g/L。駿棗果酒發(fā)酵過程中總抗氧化能力的變化如圖7，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，各組發(fā)酵的總抗氧化能力逐漸上升，發(fā)酵10 d后，BO213組和FX10組總抗氧化能力明顯高于EC1118組和RV002組。發(fā)酵期間，抗氧化能力與總酚沒有明顯的相關(guān)性，說明酵母的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)對(duì)駿棗果酒的抗氧化能力有較大影響。

圖6 駿棗果酒發(fā)酵過程中總酚質(zhì)量濃度的變化Fig.6 Changes in total phenolic contents of Jun-jujube wine during fermentation

圖7 駿棗果酒發(fā)酵過程中總抗氧化能力的變化Fig.7 Changes in total antioxidant capacities of Jun-jujube wine during fermentation

研究表明，酵母發(fā)酵可影響水果的抗氧化能力[6]。酵母可以促進(jìn)植物細(xì)胞內(nèi)溶物的釋放，并將黃酮類化合物降解成抗氧化能力更強(qiáng)的酚酸類物質(zhì)。Wang等[23]研究了桑果發(fā)酵過程中抗氧化能力的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同品種的桑果在酵母發(fā)酵過程中，DPPH自由基清除能力和鐵離子還原能力均上升；鄭嬌等[15]和Zou等[24]也有類似的報(bào)道。此外，酵母的種類對(duì)抗氧化能力也有較大影響，不同的釀酒酵母，其發(fā)酵果酒的抗氧化能力也不盡相同。研究表明，采用3種酵母菌(BV818、ICV254 和CY3079)制備的海紅果酒，其清除DPPH自由基能力和還原能力各不相同[15]，本研究結(jié)果與之相似。

3 結(jié) 論

對(duì)4種釀酒酵母發(fā)酵的駿棗果酒進(jìn)行了各項(xiàng)理化指標(biāo)和總抗氧化能力的研究，結(jié)果表明，發(fā)酵期間TSS、酒精度變化明顯，其中以EC1118和RV002酵母酒精發(fā)酵速度較快，BO213和FX10發(fā)酵速度較慢。氣相色譜分析結(jié)果表明，RV002發(fā)酵的棗酒甲醇含量高，F(xiàn)X10發(fā)酵的棗酒雜醇油含量高，而BO213發(fā)酵的棗酒甲醇和雜醇油含量均較低。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，各種釀酒酵母均能增加棗酒的抗氧化能力，以BO213發(fā)酵的棗酒總抗氧化能力最高。本研究結(jié)果說明，釀酒酵母BO213產(chǎn)酒能力較好，產(chǎn)甲醇和雜醇油的能力低，抗氧化能力高，是這4種酵母菌中最適合駿棗果酒發(fā)酵的菌種。

駿棗果酒發(fā)酵結(jié)束后還需要進(jìn)行澄清處理，因棗漿黏度較高，后續(xù)可進(jìn)一步研究駿棗果酒的澄清工藝和穩(wěn)定性，以期為駿棗果酒的開發(fā)提供更為充分的參考依據(jù)。