韓玉竹，曾兵，孟醒，吳長鳳，廖歡科，楊葉梅,2*

1(西南大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，重慶，402460)2(重慶市畜牧科學(xué)院，重慶，402460)

自然界中霉菌無處不在且種類繁多，其中大部分霉菌的存在會引起食物霉變，還有一部分霉菌則會在污染食品或飼料原料的同時(shí)，產(chǎn)生具有強(qiáng)毒性和強(qiáng)致癌性的次級代謝產(chǎn)物，包括嘔吐毒素、黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮等[1]。早在1993年世界衛(wèi)生組織(WHO)就將黃曲霉毒素劃定為I級致癌物[2]。因此，為了防止農(nóng)產(chǎn)品和飼料原料霉變造成的浪費(fèi)和危害，開發(fā)和尋找安全性好的抑菌物質(zhì)顯得尤為必要。

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是生物體自身產(chǎn)生的防御病原體入侵的小分子肽(通常分子質(zhì)量小于10 kDa)，是生物體先天免疫重要組成部分[3-4]。由于自身的蛋白質(zhì)特性、無污染、安全性及抗菌特性，其科研和應(yīng)用潛力引起國內(nèi)外農(nóng)產(chǎn)品保鮮、植物保護(hù)以及醫(yī)藥研發(fā)人員的廣泛關(guān)注[5-6]。

辣椒作為一種常用的調(diào)味品，我國每年產(chǎn)量高達(dá)2 800萬t。但占其干果重30%～60%的辣椒籽，在加工過程中卻未被充分利用，造成資源浪費(fèi)[7-8]。實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)證明辣椒籽抗菌肽對多種腐敗菌具有抑菌活性，特別能夠強(qiáng)烈抑制黃曲霉的生長，同時(shí)結(jié)合葡聚糖凝膠層析、Tricine-SDS-PAGE檢測等手段，明確辣椒籽主要抑菌成分為一種分子質(zhì)量在7.8 kDa左右的抗菌肽(PSP7.8)。本課題在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究辣椒籽抗菌肽對黃曲霉的作用方式，包括最低抑菌濃度、對黃曲霉生長、孢子萌發(fā)、養(yǎng)分吸收及細(xì)胞膜透性的影響，為辣椒籽抗菌肽的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

辣椒籽抗菌肽(PSP7.8)的制備：辣椒籽的提取方法采用試驗(yàn)室前期優(yōu)化后的步驟。具體為，辣椒所選品種為貴州燈籠椒，其辣椒籽粉碎后，用無水乙醚浸提過夜，除去粗脂肪。按料液比1∶5添加至EDTA緩沖液(10 mmol/L Na2HPO4，15 mmol/L NaH2PO4，100 mmol/L KCl, 15 g/L EDTA，pH 5.4)中，4 ℃條件下靜止16.13 h。 將浸出溶液用8層紗布過濾， 8 000 r/min離心15 min，取上清液按計(jì)量81.15%飽和度所需的硫酸銨質(zhì)量，研磨粉碎后緩慢加入，均勻攪拌至充分溶解，4 ℃靜止4 h，10 000 r/min離心15 min，沉淀冷凍干燥后為辣椒籽抗菌肽粗品。進(jìn)一步結(jié)合透析袋脫鹽，10 kDa 超濾管超濾以及葡聚糖凝膠層析對辣椒籽抗菌肽進(jìn)行分離純化，收集經(jīng)Tricine-SDS-PAGE檢測分子質(zhì)量在7.8 kDa左右的目標(biāo)抗菌肽(PSP7.8)冷凍干燥備用。

指示菌：黃曲霉(AspergillusflavusC1)，實(shí)驗(yàn)室前期從玉米上分離純化獲得，保存于西南大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 黃曲霉菌生長曲線的確定

通過稱量不同培養(yǎng)時(shí)間黃曲霉菌絲的干重來確定黃曲霉菌生長曲線。取50 μL黃曲霉孢子液(106個/mL)接入150 mL PDB培養(yǎng)基中，28 ℃下?lián)u床培養(yǎng)。每天隨機(jī)抽取3瓶抽濾獲得菌絲體，冷凍干燥至恒重后稱重。以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，菌絲體干重為縱坐標(biāo)繪制黃曲霉生長曲線。

1.3 最低抑菌濃度的測定

辣椒籽抗菌肽抑制黃曲霉的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)采用微孔法[9]。在96孔板上進(jìn)行。在孔中加入80 μL的PDB培養(yǎng)液和20 μL含約1×105個/mL黃曲霉孢子，然后在孔中分別加入梯度稀釋后的不同濃度的辣椒籽抗菌肽各100 μL，使抗菌肽的最終質(zhì)量濃度為0.019 5～5 mg/mL。 以100 μL的PBS處理作為陰性對照，觀察生長情況。每個處理重復(fù)3次。

1.4 抗菌肽對黃曲霉孢子萌發(fā)的影響

將黃曲霉于平板涂布培養(yǎng)，當(dāng)長滿平板并且產(chǎn)生大量的孢子以后，用液體培養(yǎng)基沖洗平板表面的孢子制備黃曲霉孢子懸液，并稀釋至1×106個/mL。將不同濃度抗菌肽與孢子懸浮液等體積混合，使試驗(yàn)組抗菌肽濃度分別為1倍、2倍和4倍MIC，以添加等體積無菌水做對照。將所有處理放置在28 ℃下恒溫培養(yǎng)，定時(shí)檢查對照孢子的萌發(fā)狀態(tài)。當(dāng)對照組黃曲霉孢子的萌發(fā)率超過97%后，測定全部處理組黃曲霉孢子的萌發(fā)率。根據(jù)公式(1)計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率。每個處理3次重復(fù)。

(1)

1.5 抗菌肽對黃曲霉生長的影響

在黃曲霉液體培養(yǎng)的不同階段加入MIC濃度的抗菌肽，以不加抗菌肽作為對照，經(jīng)過48 h振蕩培養(yǎng)后，觀察黃曲霉生長的差異。兩個階段：第一階段，接種0 h；第二階段，快速生長24 h。

1.6 抗菌肽對黃曲霉吸收營養(yǎng)物質(zhì)的影響

將50 μL黃曲霉孢子液(濃度為1×106個/mL)接種到PDB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)(0、24和48 h)加入同等濃度的抗菌肽溶液，使培養(yǎng)基中抗菌肽濃度達(dá)到1 MIC，所有處理放在28 ℃ 恒溫?fù)u床中連續(xù)培養(yǎng)72 h，每隔12 h從不同處理組取樣2 mL，以10 000 r/min離心15 min除去培養(yǎng)基中的菌絲體，用蒽酮比色法測定培養(yǎng)基中總糖剩余量，考馬斯亮藍(lán)G-250比色法測定其可溶性蛋白的剩余量。

1.7 辣椒籽抗菌肽對黃曲霉菌絲體細(xì)胞膜通透性的影響

為研究辣椒籽抗菌肽對黃曲霉細(xì)胞膜的影響，本試驗(yàn)利用Sytox Green染料能透過膜損傷的細(xì)胞膜而不能進(jìn)入完整細(xì)胞膜的特點(diǎn)，向處于快速生長階段的黃曲霉菌絲體中，加入1 MIC抗菌肽，在室溫下暗處孵育24 h后，加入適量的Sytox Green溶液，在黑暗條件下孵育15 min，用無菌生理鹽水漂洗2次。用熒光顯微鏡觀察不同濃度抗菌肽處理后黃曲霉菌絲體細(xì)胞膜通透性的變化，并作拍照記錄。

1.8 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用Excel處理并用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃曲霉菌的生長曲線

黃曲霉在PDB培養(yǎng)基中的生長曲線如圖1所示。黃曲霉在 1～3 d生長迅速，在生長4 d后開始出現(xiàn)下降趨勢，進(jìn)入生長衰退期。由于考慮到快速生長階段其消耗營養(yǎng)物質(zhì)的速度最快，而且24 h內(nèi)孢子還未形成，有利于觀察抗菌肽對黃曲霉孢子產(chǎn)生的影響。因此，本試驗(yàn)選擇培養(yǎng)24 h時(shí)的黃曲霉菌絲體作為后續(xù)試驗(yàn)的研究對象。

圖1 黃曲霉的生長曲線Fig.1 The growth curve of Aspergillus flavus

2.2 最低抑菌濃度(MIC)的測定

在最低抑菌濃度測定試驗(yàn)中，抗菌肽含量小于或等于78.125 μg/mL的孔中有黃曲霉菌落，并且隨著抗菌肽含量的降低，黃曲霉菌落逐漸布滿，而在抗菌肽含量高于156.25 μg/mL的孔內(nèi)均未見有黃曲霉孢子的形成或肉眼可見黃曲霉生長物出現(xiàn)，據(jù)此判定，抗菌肽對黃曲霉的最低抑菌濃度為156.25 μg/mL。

2.3 抗菌肽對黃曲霉孢子萌發(fā)的影響

由圖2可知，與對照組相比，抗菌肽能顯著抑制黃曲霉孢子的萌發(fā)，且隨濃度增高，抑制作用增強(qiáng)。在4MIC作用下可以完全抑制黃曲霉孢子的萌發(fā)。

A-不同濃度抗菌肽對黃曲霉孢子萌發(fā)率的影響；B-對照組黃曲霉孢子正常萌發(fā)狀態(tài)(18 h)；C-1MIC處理后黃曲霉孢子萌發(fā)狀態(tài)(18 h)圖2 抗菌肽對黃曲霉孢子萌芽的影響Fig.2 Effect of AMP on sprouting of Aspergillus flavus

2.4 抗菌肽對黃曲霉生長的影響

從圖3可以看出，抗菌肽在黃曲霉不同生長階段(0和24 h)加入，與對照相比，均明顯抑制黃曲霉的生長。在黃曲霉快速生長階段但還未形成孢子階段(24 h)加入156.25 μg/mL抗菌肽(MIC)培養(yǎng)至72 h(圖3-D)，與對照相比(圖3-C)，可以看出辣椒籽可以抑制黃曲霉孢子的產(chǎn)生。

A、C-對照培養(yǎng)48 h后黃曲霉生長情況;B-培養(yǎng)同時(shí)加入辣椒籽抗菌肽;D-培養(yǎng)24 h時(shí)加入抗菌肽(MIC)圖3 辣椒籽抗菌肽處理不同階段黃曲霉Fig.3 Different Stages of Aspergillus flavus treated by AMP

2.5 抗菌肽對黃曲霉吸收營養(yǎng)物質(zhì)的影響

辣椒籽抗菌肽對黃曲霉利用培養(yǎng)基中總糖和可溶性蛋白利用率的影響如圖4、圖5所示。與對照組相比，在不同時(shí)間點(diǎn)加入1MIC抗菌肽均能顯著降低黃曲霉對培養(yǎng)基中總糖和可溶性蛋白的利用率。

圖4 抗菌肽對黃曲霉總糖利用率的影響Fig.4 Effect of AMP on sugar utilization of Aspergillus flavus

圖5 抗菌肽對黃曲霉蛋白利用率的影響Fig.5 Effect of AMP on protein utilization of Aspergillus flavus

2.6 辣椒籽抗菌肽對黃曲霉菌絲體細(xì)胞膜通透性的影響

因?yàn)镾ytox Green染料能滲透到膜受損的細(xì)胞內(nèi)，但滲透不到完整的細(xì)胞膜中，所以可以用Sytox Green染料來檢測細(xì)胞膜的完整性[10-13]?？咕膶S曲霉細(xì)胞膜通透性的影響結(jié)果如圖6所示。對照組由于未加抗菌肽處理，所以其細(xì)胞膜仍處于完整狀態(tài)，因此Sytox Green染料不能進(jìn)入對照組黃曲霉菌絲體中，菌絲體內(nèi)部無綠色熒光出現(xiàn)。而經(jīng)1MIC濃度的抗菌肽處理后，菌絲體細(xì)胞出現(xiàn)了的綠色熒光信號。說明經(jīng)抗菌肽處理后，黃曲霉細(xì)胞膜的完整性遭到破壞。

A-對照組；B-培養(yǎng)24 h加入抗菌肽(1MIC)圖6 抗菌肽對黃曲霉細(xì)胞膜通透性的影響Fig.6 Effect of AMP on the permeability of Aspergillus flavus’s membrane

3 討論

黃曲霉(Aspergillusflavus)是一種常見的腐生真菌，可感染玉米和其他富含脂肪酸的食物和飼料作物，并產(chǎn)生有毒和致癌的次級代謝物——黃曲霉毒素(AFs)。除了降低農(nóng)產(chǎn)品價(jià)值導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失外，黃曲霉毒素的污染對人類和動物的健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[14-15]。隨著人們對食品安全的關(guān)注，越來越多天然安全的抗真菌物質(zhì)被科研人員關(guān)注并發(fā)現(xiàn)[16-17]。其中植物來源的天然抗真菌物質(zhì)被認(rèn)為是理想的用于改善傳統(tǒng)化學(xué)防腐劑的替代品[18]。

本試驗(yàn)提取的辣椒籽抗菌肽對黃曲霉孢子的萌發(fā)和生長都有著明顯的抑制作用，這與謝小梅等研究的肉桂醛、檸檬醛抑制黃曲霉生長和孢子萌發(fā)的結(jié)果一致[19]，說明了辣椒籽抗菌肽作為抗菌物質(zhì)的有效性。同時(shí)，試驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)低濃度的抗菌肽在未能殺死或損傷黃曲霉菌絲體的情況下依然能抑制其孢子的產(chǎn)生，這和張新虎等研究的蒼耳提取物能抑制番茄灰霉病菌孢子的產(chǎn)生結(jié)果一致[20]。

本試驗(yàn)通過研究發(fā)現(xiàn)辣椒籽抗菌肽能抑制黃曲霉對營養(yǎng)物質(zhì)吸收，這與黃現(xiàn)青研究的枯草芽孢抗菌肽抑制點(diǎn)青霉?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率[21]，以及羅曼研究的檸檬醛對黃曲霉吸收利用還原糖和蛋白質(zhì)速率的影響結(jié)果一致[22]。黃現(xiàn)青推測可能是細(xì)胞膜的損傷導(dǎo)致其喪失營養(yǎng)物質(zhì)代謝能力或者是枯草芽孢抗菌肽影響了代謝酶類的活性致使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)吸收利用受阻。但羅曼等認(rèn)為，試驗(yàn)中底物濃度遠(yuǎn)大于細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶的濃度，而黃曲霉對營養(yǎng)物質(zhì)利用的速率并未隨時(shí)間的延續(xù)而提高，而且菌絲體經(jīng)該醛作用后，胞內(nèi)Mt(線粒體)呈不規(guī)則增多，線粒體呼吸速率下降，氧化還原反應(yīng)系統(tǒng)受到破壞，琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase,SDH)、蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase,MDH)活性隨著藥物濃度的升高不可逆下降直至消失，說明檸檬醛抑制菌絲體吸收營養(yǎng)物質(zhì)不僅僅和細(xì)胞內(nèi)酶有關(guān)[23]。目前有關(guān)抑菌物質(zhì)對微生物細(xì)胞膜通透性的研究主要集中于電導(dǎo)率、胞內(nèi)大分子物質(zhì)的釋放等方面[24-26]。本研究選用Sytox Green核酸染料來研究黃曲霉細(xì)胞膜的通透性。Sytox Green染料吸收試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)抗菌肽處理后，黃曲霉細(xì)胞膜完整性遭到了破壞，同時(shí)說明抗菌肽抑制黃曲霉的生長和對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與抗菌肽破壞黃曲霉細(xì)胞膜的通透性有直接關(guān)系。