肖瑤，楊建遠*，張炳火，王萍蘭，楊云仙，查代明

1(九江學院 藥學與生命科學學院，江西 九江，332000)2(九江學院 旅游與國土資源學院，江西 九江，332000)

纖維素是廣泛現(xiàn)存于自然界中的天然可再生資源。然而纖維素為高分子難降解聚合物，其廢棄物難以被充分利用。中國每年農(nóng)作物秸稈廢棄物就有約8億多噸，其利用率十分有限，大量有機廢棄物造成能源的極大浪費[1]。由于世界能源危機問題日益嚴重，纖維素的酶法水解再利用成為酶學研究的熱點之一[2-3]。纖維素酶是指能夠水解各種天然纖維素為葡萄糖的一組酶系總稱，主要由三類功能不同但又互補的酶組成，即內切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D- glucanohydrolasease，Cx酶)、外切葡聚糖酶(cellobiohydrases，C1酶)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，βG酶)，每個組分又有若干亞組分組成[4-5]。它們可以將纖維素分解為單糖或低聚糖，如今已廣泛用于紡織、能源、造紙、印染、洗滌、飼料、食品、釀酒等多個行業(yè)[6]。產(chǎn)纖維素酶的微生物主要有細菌、放線菌、真菌和一些原生動物，其中細菌所產(chǎn)纖維素酶以Cx酶為主，但產(chǎn)酶量較低，故很少作為纖維素酶的生產(chǎn)菌株。放線菌生產(chǎn)的胞外酶大多具有一定耐堿性，而堿性纖維素酶活力較低，因此國內外對放線菌產(chǎn)纖維素酶的研究也相對較少[7]。目前，研究產(chǎn)纖維素酶的微生物以真菌為主，如木霉屬[8-9]、曲霉屬[10]、青霉屬[11-12]、孢霉屬[13-15]及脈孢霉屬[16]等。真菌菌絲生長時可橫穿次生壁進入胞腔，從內部到外部降解纖維素，導致纖維被全面徹底破壞；同時，真菌具有較全的纖維素酶酶譜，所產(chǎn)纖維素酶可分泌到胞外，產(chǎn)量較大，易分離提取[17]。目前，被廣泛認可的纖維素酶作用機制是內切β-葡聚糖酶和外切β-葡聚糖酶的協(xié)同作用，即內切β-葡聚糖酶首先作用纖維素的非結晶區(qū)，形成C1能夠作用的游離纖維素末端，然后由C1從多糖鏈的還原末端或非還原末端切下纖維二糖單位，最后由β-葡聚糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖[18-20]。

實驗室分離到1株具有產(chǎn)香特性的真菌菌株(No.F036)，經(jīng)形態(tài)學及ITS序列鑒定為白耙齒菌(Irpexlacteus)。經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)，該菌株能夠生產(chǎn)高活性纖維素酶及木質素酶[21]。研究該菌株液態(tài)發(fā)酵條件對產(chǎn)纖維素酶各酶系的影響條件及所產(chǎn)纖維素酶酶學性質，能夠為其進一步開發(fā)利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產(chǎn)香白耙齒菌F036，實驗室保藏；濾紙、微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、水楊素及3,5-二硝基水楊酸等為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

HH-4型恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；CT15RT型高速冷凍離心機，上海天美生化儀器設備工程有限公司；SKY-2102型搖床，上海蘇坤實業(yè)有限公司；UV-1200型紫外可見分光光度計，上海美普達儀器有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g，馬鈴薯(去皮)200.0 g，加水至1.0 L，自然pH。

產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：碎濾紙條10.0 g，蛋白胨10.0 g，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.8 g，加水至1.0 L，調pH 5.5～6.0。

1.2.2 粗酶液的制備

取培養(yǎng)的液態(tài)發(fā)酵物，按1∶1(體積比)的比例加入0.1 mol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉(pH=5.2)緩沖液，混勻后于4 ℃條件下1 775×g離心15 min，取上清液，即為粗酶液，備用。

1.2.3 葡萄糖標準曲線

葡萄糖標準曲線測定參照文獻方法略有改動[21]。取干燥的葡萄糖0.125 g，溶于250 mL蒸餾水中，配成0.5 g/L的葡萄糖溶液，再分別取0、10、20、30、40和50 mL于50 mL的容量瓶中，加蒸餾水定容至50 mL，以0號容量瓶中蒸餾水作為空白對照，各取0.5 mL于10 mL試管，加入3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)試劑2.5 mL后終止反應，沸水水浴顯色5 min，去離子水定容至5.0 mL，于550 nm波長下測定吸光值。以葡萄糖質量(mg)為橫坐標，以對應的吸光值為縱坐標，繪制出葡萄糖標準曲線。

1.2.4 纖維素酶活力的測定[21]

1.2.4.1 濾紙酶(filter paper activity,FPA酶)活的測定

以3片打孔器打出的濾紙小圓片(已滅菌)為底物，取粗酶液0.5 mL，50 ℃恒溫水浴30 min，添加DNS 2.5 mL終止反應，沸水浴顯色5 min，去離子水定容至5.0 mL，550 nm波長下測定OD值，再折算成酶活力。

1.2.4.2 外切葡聚糖苷酶活的測定

以0.5 mL 10 g/L或10 mg微晶纖維素溶液為底物，加入粗酶液0.5 mL，50 ℃恒溫水浴60 min，添加2.5 mL DNS終止反應，沸水浴顯色5 min，去離子水定容至5.0 mL，550 nm波長下測定OD值，再折算成酶活力。

1.2.4.3 內切葡聚糖苷酶活的測定

以1.5 mL 10 g/L羧甲基纖維素鈉鹽溶液(CMC溶液)為底物，加入粗酶液0.5 mL，50 ℃恒溫水浴30 min， 添加2.5 mL DNS終止反應，沸水浴顯色5 min，去離子水定容至5.0 mL，550 nm波長下測定OD值，再折算成酶活力。

1.2.4.4 β-葡萄糖苷酶活的測定

以0.5 mL 0.5%水楊素溶液為底物，加入粗酶液0.5 mL，50 ℃恒溫水浴30 min，添加2.5 mL DNS終止反應，煮沸顯色5 min后立即冷卻，去離子水定容至5.0 mL，于550 nm 波長下比色，測定OD值，再折算成酶活力。

酶活力測定均是以其還原糖表示酶活力，以1 mL 粗酶液1 min水解底物產(chǎn)生1 mg葡萄糖的酶量定義為1個酶活力單位，如公式(1)。

(1)

式中：M，還原糖的質量，mg；t，反應時間，min；D，稀釋倍數(shù)；Ew，粗酶液體積，mL。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)表示為3次重復實驗的平均值(mean value)和標準偏差(standard deviation，SD)，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并進行Duncan’s組間多重比較。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

以標準糖溶液測定葡萄糖含量與吸光度，得標準曲線方程為：y=0.025 3x-0.092 6(R2=0.999 2)。根據(jù)葡萄糖標準曲線推算各酶活力。

2.2 液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶規(guī)律

2.2.1 不同氮源對產(chǎn)纖維素酶的影響

將活化的菌絲體分別定量接種于氮源為硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、蛋白胨和豆粉的產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基上，氮源添加量均為10 g，培養(yǎng)基調初始pH值為5.2，培養(yǎng)溫度28 ℃，搖床轉速160 r/min，4 d后提取發(fā)酵液，制備粗酶液測定各酶活力，選定最佳氮源(圖1)。

圖1 液態(tài)發(fā)酵條件下不同氮源對產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.1 Effect of different nitrogen sources on the activity of cellulase

由圖1可知，氮源為蛋白胨時，F(xiàn)PA酶、C1酶、Cx酶和βG酶活力達到最高，分別為2.199、1.438、152.821 和11.788 IU/mL。陸晨等[23]從湖北神農(nóng)架保護區(qū)的森林腐質土壤中篩選分離后得到1株高產(chǎn)纖維素酶真菌B-5，當?shù)礊榈鞍纂藭r，B-5能夠達到最高酶活力。然而，趙連娣等[24]研究顯示，以硫酸銨為氮源時，綠色木霉L4C液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶達到最佳酶活力?？梢姡緦嶒灧蛛x到的白耙齒菌F036在產(chǎn)纖維素酶方面與從湖北神農(nóng)架保護區(qū)的森林腐質土壤中分離到的真菌B-5結果類似。蛋白胨為有機氮源，營養(yǎng)成分多種多樣，含有豐富的氨基酸和多肽，為微生物的生長提供了充足的養(yǎng)分，豆粉營養(yǎng)成分含量相對蛋白胨較低，而硫酸銨，氯化銨，硝酸銨這些無機氮源營養(yǎng)成分單一。所以，蛋白胨相比于豆粉和這些單一氮源對酶生長有良好的促進作用。本菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中選用蛋白胨為氮源。

2.2.2 初始pH對產(chǎn)纖維素酶的影響

在最佳氮源為蛋白胨的情況下，將產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基初始pH分別調至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 和 9.0， 其余成分不變，培養(yǎng)溫度28 ℃，搖床轉速160 r/min，4 d后提取發(fā)酵液測定酶活，選定最佳初始pH(圖2)。

由圖2可知，當初始pH為5.0時，Cx酶和βG酶活力達到最高，分別為257.923和13.586 IU/mL；當初始pH為6.0時，F(xiàn)PA酶和C1酶活力達到最高，分別為3.131和1.412 IU/mL。

可見，在偏酸性、中性、偏堿性條件下，該菌株都有產(chǎn)纖維素酶活性，但是在pH 9.0時，該菌株幾乎不產(chǎn)纖維素酶。曾青蘭等[25]在腐爛的稻草秸稈中分離到一株絲狀真菌Gibberellafujikuroi，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基pH為5.0～6.0時Gibberellafujikuroi產(chǎn)纖維素酶酶量達到最高，F(xiàn)PA酶和Cx酶活分別達到0.344和1.723 IU/mL。最適pH值與本研究的白耙齒菌F036的最適培養(yǎng)基初始pH值相近。因為2株菌都是耐酸性的真菌(本實驗菌株F036的最適生長pH為5.0～6.0)，在偏酸條件下生長產(chǎn)酶較好，當初始pH越接近酶的最適生長pH，纖維素底物的消耗速率越高，發(fā)酵液中纖維二糖的產(chǎn)率也就越高[26]。此外，在選擇培養(yǎng)基適宜pH時，還要考慮到酶生長代謝物對培養(yǎng)基的影響。因此，本菌最適產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵pH為5.0～6.0。

圖2 不同初始pH液態(tài)發(fā)酵條件對產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.2 Effect of initial pH on the activity of cellulase

2.2.3 發(fā)酵時間對產(chǎn)纖維素酶的影響

確定最佳氮源和初始pH的情況下，將活化的菌絲體分別定量接種于含有濾紙條誘導物的產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度28 ℃，搖床轉速160 r/min，每天同一時間取發(fā)酵液，制備粗酶液測定各酶活力，取樣至第8天，選定最佳培養(yǎng)時間(圖3)。

圖3 發(fā)酵時間對產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.3 Effect of culture time on the activities of cellulose

由圖3可知，3～4 d時，產(chǎn)酶量增加最為顯著(P<0.05)， 4 d后酶活趨于平穩(wěn)，可見4～7 d為主要產(chǎn)酶階段，在4 d時，F(xiàn)PA酶、Cx酶和βG酶酶活達到最高，分別為2.058、174.536和3.079 IU/mL，在5 d 時，C1酶酶活達到最高，為1.401 IU/mL，其中Cx酶酶活顯著高于(P<0.05)FPA酶、C1酶和βG酶，此現(xiàn)象也出現(xiàn)在宋賢沖等[27]篩選的木霉屬菌株F01中，菌株F01的FPA酶、C1酶和Cx酶活力分別為0.12、 0.10和4.00 IU/mL。而甄靜等[28]研究的球孢枝孢菌GC2-2所產(chǎn)的CMC酶(Cx酶)活力卻低于FPA酶活力，同樣的現(xiàn)象在黃春凱等[29]研究的菌株中也有報道。纖維素酶系作用的底物不同表現(xiàn)出酶活力會有不同，該菌液態(tài)發(fā)酵的酶液中，當作用的底物為羧甲基纖維素鈉時酶活力達到最高，而以濾紙、微晶纖維素為底物時酶活力都更低。這可能的原因為濾紙和微晶纖維素的結構與天然纖維素更為相似，而羧甲基纖維素鈉卻是纖維素的衍生物，與天然纖維素相比會暴露出更多與纖維素酶結合的位點[27]。同時，該菌所產(chǎn)Cx酶酶活力明顯高于已報道的多數(shù)菌株。例如，韓愈杰等[30]篩選的枝頂孢屬菌株H-3，優(yōu)化后Cx酶活為13.57 IU/mL；韓樹英等[31]獲得的褐腐真菌CY-2012，Cx酶酶活最高為21.71 U/mL；鄒瀟瀟等[32]分離的草酸青霉DF14101菌株的發(fā)酵液中的Cx酶酶活力最高為43.98 U/mL。從其發(fā)酵時間影響條件下所產(chǎn)纖維素酶活力曲線趨勢看，F(xiàn)PA酶、C1酶、Cx酶及βG酶的產(chǎn)酶趨勢基本一致，液態(tài)發(fā)酵時間超過4 d時，纖維素酶活逐漸下降，這是因為發(fā)酵后期已生產(chǎn)的酶失活或分解，及菌體自身的衰老，故產(chǎn)酶量有所下降。因此，本菌產(chǎn)纖維素酶最佳培養(yǎng)時間為4 d。

2.3 酶學性質研究

2.3.1 反應溫度對纖維素酶酶活力的影響

以優(yōu)化后的產(chǎn)酶條件進行發(fā)酵產(chǎn)酶，制備粗酶液。將酶促反應溫度分別設置為30、40、50、60、70 和80 ℃，按1.2.3方法在各個溫度下進行4個酶的酶促反應，測定各酶活力，選定最佳反應溫度(圖4)。

圖4 反應溫度對產(chǎn)纖維素酶活力的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on the activities of celluloses

由圖4可知，從40 ℃增加到50 ℃時，各酶酶活力增加最為顯著(P<0.05)，并且均達到最高。FPA酶、C1酶、Cx酶和βG酶的最適反應溫度為50 ℃，其酶活力分別為3.663、2.217、587.530和23.290 IU/mL，這與趙萍等[33]從枯葉下的土壤中分離得到的羊毛狀青霉(Penicilliumlanosum)PL2的酶學性質類似，該菌株在反應溫度為50 ℃時Cx酶活力最高，達到26.50 mg/L。βG酶的溫度耐受泛圍相對較大，在70 ℃下還能保持較高的酶活，這與梁翠誼等[34]從枯葉下的土壤中分離篩選得到得肉座菌Hyppcreasp. W63所產(chǎn)βG酶相似。隨著反應溫度繼續(xù)增加到80 ℃，各酶酶活力也逐漸下降并不斷趨近于0。因為溫度過高會使酶失活，而溫度太低不能達到酶的最適反應條件?？梢姡摼晁a(chǎn)纖維素酶最佳酶促反應溫度為50 ℃。

2.3.2 反應pH對纖維素酶酶活力的影響

配制pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液，pH為分別7.0、8.0的0.1 mol/L磷酸緩沖液，用不同pH緩沖液稀釋粗酶液，并分別用各pH緩沖液配置10 g/L微晶纖維素溶液、10 g/L羧甲基纖維素鈉(CMC)溶液、5 g/L水楊素溶液。按1.2.3方法在各個pH下進行4個酶的酶促反應，測定各酶活力，選定最佳反應pH(圖5)。

圖5 反應pH對產(chǎn)纖維素酶活力的影響Fig.5 Effect of reaction pH on the activities of celluloses

由圖5可知，隨著pH的增加，產(chǎn)纖維素酶(FPA酶、C1酶、Cx酶和βG酶)活力呈現(xiàn)明顯的先增加后下降的趨勢。反應pH為5.0時FPA酶、C1酶、Cx酶和βG酶活力都達到最高，分別為2.309、0.483、118.881和4.181 IU/mL，這與聶志強[35]于土壤中分離到的一株高產(chǎn)纖維素酶的綠色木霉菌S5相似，綠色木霉菌S5與白耙齒菌F036同為耐酸菌，反應pH為5.5 時，S5所產(chǎn)纖維素酶相對酶活達到100%，在高于和低于5.5時，相對酶活均在100%以下。其原因在于pH值的改變會影響酶活性部位的解離，在最適反應pH值時，纖維素酶分子上活性基團所處的解離狀態(tài)最容易和底物相結合，當高于或低于最適pH值時，纖維素酶活性基團的解離狀態(tài)發(fā)生了變化，酶和底物結合的作用力隨之降低[36]，導致纖維素酶催化反應的速率降低?？梢?，白耙齒菌F036所產(chǎn)纖維素酶的最適反應pH為5.0。

2.3.3 不同金屬離子對纖維素酶酶活力的影響

分別配制0.3 mg/mL FeSO4、CuSO4、MnSO4、CoCl2、Fe2(SO4)3、K2SO4、ZnSO4、CaCl2和MgSO4溶液。按1.2.3方法在各酶反應體系中添加各金屬離子溶液0.5 mL，空白對照組添加去離子水0.5 mL，進行4個酶的酶促反應，測定各種金屬離子對酶活力的影響(圖6)。

圖6 不同金屬離子對產(chǎn)纖維素酶活力的影響Fig.6 Effect of different metal ions on the activities of celluloses

由圖6可知，當粗酶液中金屬離子質量濃度為0.15 mg/mL 時，對FPA酶活力的促進作用的離子為Mg2+、Zn2+、K+、Ca2+、Co2+、Fe3+和Fe2+，其促進率分別為15.93%、14.38%、12.36%、7.54%、6.14%、4.66%和4.35%，而抑制FPA酶活力的離子為Mn2+，抑制率為24.09%， Cu2+對FPA酶無明顯影響(P>0.05)；對C1酶活力促進作用為Cu2+，其促進率達8.07%，而對C1酶有抑制作用的離子為：Mn2+、Zn2+、Co2+、Fe2+、Fe3+、Mg2+、K+和Ca2+，其抑制率分別為28.60%、16.41%、15.88%、12.35%、8.23%、5.77%、 4.60%和3.26%；對Cx酶有促進作用的離子為：Fe2+、Co2+、K+和Ca2+，其促進率分別為28.95%、11.69%、1.53%和1.19%，而對Cx酶有抑制作用的離子為：Zn2+、Cu2+、Mg2+和Fe3+，其抑制率分別為12.09%、11.03%、9.70%和6.83%，Mn2+對Cx酶無明顯作用(P>0.05)；對βG酶有促進作用的離子為：Co2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、K+和Fe3+，其促進率分別 為44.07%、28.12%、16.97%、6.07%、3.55%和1.82%，而Ca2+、Zn2+、Mg2+對βG酶活力無明顯作用(P>0.05)，未發(fā)現(xiàn)對βG酶有明顯抑制作用的離子。

在王金成[37]的研究中，添加4 mg/g的Fe2+和9 mg/g 的Mn2+均能達到最高糖化率。韓龍等[38]研究表明金屬離子對HD 1031的纖維素酶有正向促進作用，Ca2+和Mg2+對酶的促進作用明顯，而Mn2+對酶有抑制作用。某些金屬離子可能會導致酶結構發(fā)生改變，影響酶與底物的接觸面積，但對于不同離子，其影響酶的活力要求的濃度存在差異。離子種類及濃度的不同，對各酶活力有不同的影響，因此，添加適量的金屬離子有助于提高酶活力[34]。本實驗在質量濃度0.15 mg/mL下，有可能還未達到某些離子最適促進酶活所需的濃度。

3 結論

白耙齒菌F036液態(tài)發(fā)酵最佳產(chǎn)纖維素酶條件為：培養(yǎng)基包含KH2PO4，MgSO4·7H2O及碎濾紙條，以蛋白胨為氮源，初始pH為5.0～6.0，發(fā)酵4 d。在此產(chǎn)酶條件下，發(fā)酵液中FPA酶、C1酶、Cx酶及βG酶活力最高可分別達到2.058、1.401、174.536、3.079 IU/mL，其中Cx酶活力明顯比FPA酶、C1酶及βG酶高?？梢姡装引X菌F036菌株產(chǎn)Cx酶具有明顯優(yōu)勢。

白耙齒菌F036液態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)纖維素酶的FPA酶、C1酶、Cx酶及βG酶的最適反應pH均為5.0；最適反應溫度均為50 ℃；金屬離子質量濃度為0.15 mg/mL時，Mg2+對FPA酶有最大促進作用，Cu2+對C1酶有較弱促進作用，而Mn2+對FPA酶及C1酶有最明顯抑制作用，F(xiàn)e2+對Cx酶有最大促進作用，Zn2+對Cx酶有最明顯抑制作用，Co2+對βG酶具有最顯著促進作用。