賈 賓,陳慧心,韓瑩倩,郭玉堃,邵科宇,郭豫杰

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院/農(nóng)業(yè)部 動(dòng)物生化與營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450002)

禽流感病毒(avian influenza virus)屬于正粘病毒科,為負(fù)鏈單股RNA病毒,含有8個(gè)節(jié)段[1]。流感病毒粒子表面有兩種蛋白,分別為血凝素(Hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuramindase, NA)。血凝素是流感病毒囊膜纖突的主要成分,為一種糖蛋白,在病毒吸附及穿膜的過程中起關(guān)鍵作用；由于HA具有較高的變異率,因此它是引發(fā)流感病毒發(fā)生抗原變異的主要因素[2]。目前禽流感免疫主要通過傳統(tǒng)的滅活單價(jià)苗、多聯(lián)苗或者類毒素疫苗而實(shí)現(xiàn),這些傳統(tǒng)疫苗雖然能夠誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生一定的保護(hù)性抗體,但是它們存在安全性不高、穩(wěn)定性差、免疫后副作用大等缺點(diǎn)[3-4]。基因工程亞單位多價(jià)疫苗含有產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答所必需的有效免疫成分,同時(shí)去除了與免疫無關(guān)的成分,因而相對(duì)于傳統(tǒng)疫苗而言其安全性、穩(wěn)定性更好,而且消除了傳統(tǒng)疫苗成分中熱原、變應(yīng)原等反應(yīng)原,很好地解決了傳統(tǒng)疫苗免疫后動(dòng)物出現(xiàn)的副作用與炎性刺激問題[5]。因此,開發(fā)一種能夠預(yù)防禽流感的基因工程亞單位疫苗成為禽流感病防控技術(shù)中迫切需要解決的問題[6]。

CnaB2是釀膿鏈球菌纖維聯(lián)接蛋白黏附蛋白FbaB的一個(gè)結(jié)構(gòu)域,是細(xì)菌侵入人體的必需結(jié)構(gòu)[7]。Mark Howarth研究團(tuán)隊(duì)從CnaB2中分離了N-末端帶有Lys31、C-末端帶有Asp117的能夠進(jìn)行自發(fā)共價(jià)結(jié)合的 SpyTag/SpyCatcher,該反應(yīng)可以在短時(shí)間內(nèi)自發(fā)進(jìn)行[8-10]?；诖碎_發(fā)了一種新的蛋白質(zhì)連接技術(shù)——Spyligase技術(shù)。基于全新的Spyligase蛋白質(zhì)連接技術(shù), Liu等開發(fā)出一種用于人造疫苗的合成新方法,該方法簡單易行,在對(duì)蛋白進(jìn)行最小化修飾下,抗原蛋白可以形成環(huán)化單體、二聚體甚至多聚體,研究表明多聚體的形成可以增強(qiáng)疫苗的免疫效果[11]。目前在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)HA蛋白方面的報(bào)道并不少,但是將環(huán)化技術(shù)應(yīng)用到HA蛋白的報(bào)道還沒有。本研究利用Spyligase技術(shù)對(duì)禽流感H5亞型HA蛋白進(jìn)行了改造,并利用DNA重組技術(shù)在目的基因序列的兩端分別加上SpyTag和KTag序列,成功構(gòu)建了含9種促溶標(biāo)簽的Spy-H5HA10重組蛋白表達(dá)載體和Spyligase重組蛋白表達(dá)載體；經(jīng)用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),純化目的蛋白,體外環(huán)化驗(yàn)證,在PCT緩沖液中成功獲得了Spy-H5HA10重組蛋白的多聚體混合物。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Spyligase技術(shù)在體外可以指導(dǎo)H5HA10蛋白形成多聚體,這為后續(xù)將H5HA10多聚體抗原應(yīng)用于基因工程疫苗的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、表達(dá)載體pET-21b均由本實(shí)驗(yàn)室提供;帶有不同融合標(biāo)簽的10種質(zhì)粒pEX-His6-ArsC-TEV-LIC、pEX-His6-Cherry-TEV-LIC、pEX-His6-PAS200-TEV-LIC、pEX-His6-XTEN-TEV-LIC、pEX-His6-PEAT-TEV-LIC、pEX-SiTag3-SUMO-TEV-LIC、pEX-SiTag3-MBP-TEV-LIC、pEX-SiTag3-PAS200-TEV-LIC、pEX-SiTag3-XTEN-TEV-LIC和pEX-SiTag3-ArsC-TEV-LIC為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保存;限制性內(nèi)切酶BamH I、Xho I、Nde I和T4 DNA連接酶(TaKaRa);DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000、DL5000(TaKaRa); Agarose(GENVIEN公司);考馬斯亮藍(lán)R-250、吐溫、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropylthio-β-D-galactoside, IPTG) (北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司); Ni-NTA Agarose (Qiagen)購自天馳生物科技有限公司; SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(上海生工);檸檬酸、氧化三甲胺(TMAO)(Sigma)。

1.2 Spy-H5HA10基因的設(shè)計(jì)與合成

1.3 高效可溶性融合表達(dá)載體的構(gòu)建

將本實(shí)驗(yàn)室保存的含有不同促溶標(biāo)簽的質(zhì)粒pEX-His6-ArsC-TEV-LIC、pEX-His6-PAS200-TEV-LIC、pEX-His6-XTEN-TEV-LIC、pEX-His6-PEAT-TEV-LIC、pEX-SiTag3-SUMO-TEV-LIC、pEX-SiTag3-MBP-TEV-LIC、pEX-SiTag3-PAS200-TEV-LIC、pEX-SiTag3-XTEN-TEV-LIC和pEX-SiTag3-ArsC-TEV-LIC分別用BamH I和Xho I進(jìn)行雙酶切,經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳,用柱式DNA膠回收試劑盒回收,產(chǎn)物于-20 ℃保存。目的基因Spy-H5HA10經(jīng)PCR擴(kuò)增,1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離,用柱式DNA膠回收試劑盒切膠回收,與pMD19-T載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a,涂布于Amp(100 mg/mL)固體培養(yǎng)基,挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定并送測(cè)序；鑒定成功后提取質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Xho I和BamH I酶切,酶切產(chǎn)物分別與上述回收的9種載體片段連接,于16 ℃過夜,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3),挑取陽性克隆測(cè)序,將測(cè)序正確的9種Spy-H5HA10重組載體保存菌種。目的基因Spyligase和pEX-His6-Cherry-TEV-LIC載體分別經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段,T4 DNA連接酶連接,構(gòu)建新的重組載體pEX-His6-Cherry-TEV-Spyligase,測(cè)序正確后保存菌種。目的基因在載體中的連接順序如圖1所示。

圖1 目的基因在重組表達(dá)載體中的連接順序

1.4 蛋白表達(dá)與可溶性分析

將含9種Spy-H5HA10重組載體和pEX-His6-Cherry-TEV-Spyligase重組載體的E.coliBL21甘油菌活化后誘導(dǎo)表達(dá),并對(duì)IPTG的濃度(0.2、0.5、0.8 mmol/L)及誘導(dǎo)溫度(18、25 ℃)進(jìn)行優(yōu)化。誘導(dǎo)結(jié)束后于4 ℃、9000 r/min離心30 min,分別收集上清和沉淀,經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳,檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)。使用ImageJ進(jìn)行灰度掃描,分析重組蛋白的可溶性表達(dá)水平,篩選出最佳誘導(dǎo)條件。

1.5 蛋白的純化

將陽性菌液接種至1L LB(Amp 100 mg/mL)液體培養(yǎng)基中,擴(kuò)大培養(yǎng),當(dāng)OD600為0.6～0.8時(shí),加入IPTG,在25 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)12 h后,于4 ℃、8000 r/min離心10 min，收集菌體,用平衡緩沖液(1 mol/L NaCl、50 mmol/L NaH2PO4、5 mmol/L咪唑)重懸沉淀,低溫超聲破碎菌體；將破碎后的混合液在4 ℃下以12000 r/min離心30 min,收集上清,加到預(yù)處理的Ni-NTA填料中,低溫結(jié)合1 h,分別用洗雜緩沖液(1 mol/L NaCl、50 mmol/L NaH2PO4、5/10/15/20/25/50/75/100/250/300 mmol/L咪唑)洗脫雜蛋白,篩選洗雜緩沖液后,加大洗脫體積,最后用洗脫緩沖液(1 mol/L NaCl、50 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L咪唑)洗脫,收集洗脫的融合蛋白,用超濾管和脫鹽柱脫鹽濃縮,再用BCA蛋白定量試劑盒定量,于-80 ℃保存。

1.6 Spy-H5HA10多聚體的形成

將脫鹽處理后定量的蛋白按照1∶3到3∶1之間的比例設(shè)置濃度梯度進(jìn)行加樣處理,如表1所示,在4 ℃ PCT緩沖液[12]中反應(yīng),每6 h取樣1次,于99 ℃變性10 min,經(jīng)SDS-PAGE分析,確定最佳反應(yīng)條件。

表1 Spyligase與H5HA10反應(yīng)的比例

注:1、2、11、12孔為對(duì)照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體的酶切

經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切，獲得含有9種促溶標(biāo)簽的線性載體,電泳顯示目的片段大小與預(yù)期一致(圖2A); pET21b-His6-Cherry載體由BamH I和Xho I雙酶切線性化,電泳顯示獲得了含有His6-Cherry可溶性標(biāo)簽的片段,大小與預(yù)期相符(圖2B)。

M： DL 5000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～9： pET21b-His-ArsC、pET21b-His-PAS200、pET21b-His-XTEN、pET21b-His-PEAT、pET21b-SiTag3-SUMO、pET21b-SiTag3-MBP、pET21b-SiTag3-PAS200、pET21b-SiTag3-XTEN和pET21b-SiTag3-ArsC;11～13： pET21b-His6-Cherry。

圖2載體的酶切結(jié)果

2.2 目的基因Spy-H5HA10和Spyligase的獲得

測(cè)序正確的pMD19-T-Spy-H5HA10重組質(zhì)粒通過BamH I和Xho I雙酶切獲得目的基因Spy-H5HA10,其片段大小為534 bp,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示與預(yù)期大小一致(圖3A);含有Spyligase序列的重組質(zhì)粒,經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切得到Spyligase基因片段,該片段大小為333 bp,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示與預(yù)期大小一致(圖3B)。

M： DL 5000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～8： Spy-H5HA10經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切獲得目的基因片段;9～11： Spyligase經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切獲得目的基因片段。

圖3BamHI和XhoI雙酶切獲得的目的片段

2.3 重組質(zhì)粒的鑒定

將9種含有目的基因Spy-H5HA10的重組質(zhì)粒經(jīng)Xho I 和Nde I雙酶切,片段大小分別為1176、1176、966、1434、1191、1434、1713、1089、1089 bp,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示與預(yù)期片段大小相符(圖4A)；同時(shí)測(cè)序結(jié)果顯示9種重組質(zhì)粒序列無堿基突變,重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。含有Spyligase目的基因的融合標(biāo)簽重組質(zhì)粒經(jīng)Xho I 和Nde I雙酶切,電泳顯示在630 bp處有與預(yù)期片段大小相符的條帶(圖4B),測(cè)序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pET21b-His6-Cherry-Spyligase構(gòu)建成功。

1～9： pET21b-His-PAS200-H5HA10、pET21b-SiTag3-PAS200-H5HA10、pET21b-SiTag3-SUMO-H5HA10、pET21b-SiTag3-XTEN-H5HA10、pET21b-His-PEAT-H5HA10、pET21b-His-XTEN-H5HA10、pET21b-SiTag3-MBP-H5HA10、pET21b-His-ArsC-H5HA10、pET21b-SiTag3-AesC-H5HA10;10～12： pET21b-His6-Cherry-Spyligase。

圖49種重組質(zhì)粒NdeI和XhoI雙酶切鑒定結(jié)果

2.4 含有目的基因Spy-H5HA10的9種重組蛋白的可溶性分析

SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)顯示, pET21b-His-PAS200-H5HA10和pET21b-SiTag3-PAS200-H5HA10(圖5A、圖5B)條帶大小與預(yù)期不符；其余7種融合標(biāo)簽重組載體的電泳結(jié)果顯示在35.42、52.58、43.67、52.58、62.81、39.93、39.93 kDa處有與預(yù)期大小相一致的條帶(圖5C、圖5D、圖5E、圖5F、圖5G、圖5H、圖5I)。ImageJ軟件分析表明, pET21b-His-ArsC-H5HA10(圖5H )、pET21b-SiTag3-ArsC-H5HA10(圖5I)目的蛋白的表達(dá)量均高于其他組的,約占菌體總蛋白的30%,且蛋白大部分在上清中,可溶性在90%以上,His-Tag的純化更為簡單,故選擇pET21b-His-ArsC-H5HA10做后續(xù)研究。

2.5 His-ArsC-H5HA10融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

經(jīng)0.2 mmol/L和0.5 mmol/L終濃度的IPTG誘導(dǎo)后，目的蛋白的表達(dá)量相對(duì)較高,表達(dá)量達(dá)30%,但是0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)時(shí)蛋白可溶性為80%,0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)時(shí)蛋白可溶性可達(dá)90%以上,終濃度0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)時(shí)效果相對(duì)較差,目的蛋白的可溶性降低(圖6A); His-ArsC-H5HA10經(jīng)18 ℃和25 ℃兩個(gè)溫度誘導(dǎo)后,25 ℃下的蛋白表達(dá)量較18 ℃有所提高,且可溶性表達(dá)水平也高于18 ℃下的,蛋白可溶性水平達(dá)90%以上,因此 25 ℃為最佳誘導(dǎo)溫度(圖6B)。

M:蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); A: pET21b-His6-PAS200-H5HA10; B: pET21b- SiTag3-PAS200-H5HA10; C: pET21b-SiTag3-SUMO-H5HA10; D: pET21b-SiTag3-XTEN-H5HA10; E: pET21b-His-PEAT-H5HA10; F: pET21b-His-XTEN-H5HA10; G: pET21b-SiTag3-MBP-H5HA10; H: pET21b-His-ArsC-H5HA10; I: pET21b-SiTag3-ArsC-H5HA10 ;1:未誘導(dǎo)全菌;2:誘導(dǎo)后全菌;3:誘導(dǎo)后超聲破碎的上清;4:誘導(dǎo)后超聲破碎的沉淀。

圖5Spy-H5HA10重組蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果

M:蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:未誘導(dǎo)的全菌;2:0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的全菌;3:0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的全菌;4:0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的全菌;5:0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的上清;6:0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的上清;7:0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的上清;8:0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的沉淀;9:0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的沉淀;10:0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的沉淀;11:未誘導(dǎo)的全菌;12:25 ℃誘導(dǎo)后的全菌;13:25 ℃誘導(dǎo)后的上清;14:18 ℃誘導(dǎo)后的全菌;15:18 ℃誘導(dǎo)后的上清;16:25 ℃誘導(dǎo)后的沉淀;17:18 ℃誘導(dǎo)后的沉淀。

圖6His-ArsC-H5HA10融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化結(jié)果

2.6 Spyligase重組蛋白的可溶性分析

重組質(zhì)粒pEX-His6-Cherry-TEV-Spyligase轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、超聲破碎后取上清和沉淀,用SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示在26 kDa處有與預(yù)期大小相符的目的條帶(圖7)。ImageJ軟件分析數(shù)據(jù)表明, Spyligase重組蛋白的可溶性約為95%。

M:蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:未誘導(dǎo)的全菌;2:誘導(dǎo)后的全菌;3:誘導(dǎo)后的上清;4:誘導(dǎo)后的沉淀。

圖7Spyligase重組蛋白SDS-PAGE分析結(jié)果

2.7 Spyligase重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

用終濃度分別為0.2、0.5和0.8 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),再經(jīng)SDS-PAGE電泳, ImageJ軟件分析顯示：0.2 mmol/L和0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)時(shí)蛋白表達(dá)量均高于0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)時(shí)的,但是0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)時(shí)蛋白的可溶性表達(dá)水平不及0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)時(shí)的；0.8 mmol/L IPTG的誘導(dǎo)效果最差(圖8A)。在18 ℃和25 ℃下分別誘導(dǎo),經(jīng)SDS-PAGE電泳, ImageJ軟件分析顯示,誘導(dǎo)溫度為25 ℃時(shí)重組蛋白的表達(dá)量和可溶性水平均高于18 ℃的,可溶性達(dá)95%(圖8B)。

2.8 重組蛋白His-ArsC-H5HA10的純化

用平衡緩沖液重懸菌體,超聲破碎后分別用含10、20、30、50、75、100、250、500 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫,SDS-PAGE電泳分析顯示目的蛋白可以通過鎳柱進(jìn)行親和純化,用30 mmol/L的咪唑緩沖液洗脫雜蛋白的效果最佳(圖9A)。目的蛋白與鎳柱結(jié)合后,用10、20、30、500 mmol/L咪唑的緩沖液梯度洗脫,收集目的蛋白,經(jīng)脫鹽處理后得到了高純度的重組蛋白(圖9B)。

M:蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:未誘導(dǎo)的全菌;2:0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的全菌;3:0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的全菌;4:0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的全菌;5:0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的上清;6:0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的上清;7:0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的上清;8:0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的沉淀;9:0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的沉淀;10:0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的沉淀;11:未誘導(dǎo)的全菌;12:25 ℃誘導(dǎo)后的全菌;13:25 ℃誘導(dǎo)后的上清;14:18 ℃誘導(dǎo)后的全菌;15:18 ℃誘導(dǎo)后的上清;16:25 ℃誘導(dǎo)后的沉淀;17:18 ℃誘導(dǎo)后的沉淀。

圖8Spyligase重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化結(jié)果

M:蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:破碎后上清;2～12:分別含10、20、30、40、50、75、100、200、250、300、500 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液;13:未誘導(dǎo)的全菌;14:誘導(dǎo)后的上清;15:純化的His-ArsC-H5HA10重組蛋白。

圖9His-ArsC-H5HA10融合蛋白純化條件優(yōu)化結(jié)果

2.9 重組蛋白His-Cherry-Spyligase的純化

操作方法與2.7.1一致,圖10A結(jié)果顯示用含50 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫雜蛋白的效果最佳。目的蛋白與鎳柱結(jié)合后,經(jīng)10、20、30、50、500 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫,收集目的蛋白,經(jīng)脫鹽處理后得到了高純度的His-Cherry-Spyligase重組蛋白(圖10B)。

2.10 Spyligase和Spy-H5HA10反應(yīng)的最佳比例

將已純化的重組蛋白Spyligase和His-ArsC- Spy-H5HA10按照表1分別加入到PCT緩沖溶液中,于4 ℃下反應(yīng)48 h。SDS-PAGE分析顯示：在Spyligase量一定的條件下,多聚體的形成量與底物Spy-H5HA10的單體濃度呈正相關(guān)(圖11B);當(dāng)Spy-H5HA10的量一定時(shí),多聚體的形成量隨著Spyligase濃度的增高而升高,但是當(dāng)Spy-H5HA10和Spyligase的比例達(dá)到1∶2時(shí),再升高Spyligase的量對(duì)形成多聚體無明顯影響(圖11A),因此最終確定Spy-H5HA10和Spyligase反應(yīng)的最佳比例為1∶2。

M:蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:破碎后的上清;2～12:分別含10、20、30、40、50、75、100、200、250、300、500 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液;13:未誘導(dǎo)的全菌;14:誘導(dǎo)后的上清;15:純化的His-Cherry-Spyligase重組蛋白。

圖10His-Cherry-Spyligase融合蛋白純化條件優(yōu)化結(jié)果

M:蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～20:與表1中的樣孔號(hào)對(duì)應(yīng)。

M:蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1: Spyligase 融合蛋白;2: Spy-H5HA10融合蛋白;3: Spyligase與Spy-H5HA10以1∶1混合;4:環(huán)化6 h;5:環(huán)化12 h;6:環(huán)化18 h;7:環(huán)化24 h;8:環(huán)化30 h;9:環(huán)化36 h;10:環(huán)化42 h;11:環(huán)化48 h;12:環(huán)化54 h;13:環(huán)化60 h;14:環(huán)化66 h。

圖12Spyligase和Spy-H5HA10反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果

2.11 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

將Spy-H5HA10和Spyligase以1∶2混合進(jìn)行反應(yīng),每6 h取樣1次,分析反應(yīng)時(shí)間與環(huán)化形成量的關(guān)系。SDS-PAGE凝膠電泳分析結(jié)果(圖12)表明：在反應(yīng)6 h時(shí)已發(fā)生環(huán)化,出現(xiàn)了環(huán)化單體和三聚體，且隨著反應(yīng)時(shí)間的延長,環(huán)化單體和三聚體的數(shù)量逐漸增加;在18 h時(shí),開始出現(xiàn)六聚體,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長,六聚體的數(shù)量逐漸增加;在24 h時(shí),開始出現(xiàn)九聚體,繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間,環(huán)化單體及多聚體的數(shù)量都有所增加;在反應(yīng)30～66 h期間，環(huán)化單體、三聚體、六聚體以及九聚體的形成量均無明顯增加。

3 討論

禽流感是由A類病毒引起的一類對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重危害的高度傳染性疾病,也是一種人獸共患傳染病[13]。目前對(duì)于禽流感的防治以滅活苗、弱毒苗或抗原蛋白亞單位疫苗為主,但是這些疫苗免疫保護(hù)性水平往往較低。有學(xué)者應(yīng)用Spyligase技術(shù)在體外環(huán)化生成環(huán)化單體、多聚體，增大蛋白分子量,提高蛋白的穩(wěn)定性,獲得了較好的免疫效果[11-12〗。Spyligase技術(shù)源于SpyTag/SpyCatcher的連接反應(yīng),由SpyTag、KTag和鏈接酶Spyligase組成[11],可用于蛋白質(zhì)分子的連接。KTag設(shè)計(jì)來源于SpyCatcher,在Spyligase的作用下可以與SpyTag形成共價(jià)鍵;Spyligase也來源于SpyCatcher,經(jīng)人工改造后合成[11]。本實(shí)驗(yàn)在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了Spy-H5HA10和Spyligase重組蛋白,原核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)成本低,操作簡單易行[15]。有文獻(xiàn)報(bào)道在蛋白表達(dá)中可以通過促溶標(biāo)簽提高蛋白的可溶性[16]。本研究應(yīng)用SiTag3[17]、XTEN[18]、MBP[19]、Cherry[21]、SUMO、PAS200等10種促溶標(biāo)簽與目的蛋白進(jìn)行融合表達(dá),從中篩選出了高可溶性的His6-ArsC-H5HA10重組蛋白。PAS200標(biāo)簽與蛋白的串聯(lián)結(jié)構(gòu)在表達(dá)后, SDS-PAGE電泳顯示其融合蛋白偏大,究其原因，可能是由于本實(shí)驗(yàn)所用的PAS200標(biāo)簽所含氨基酸序列具有特殊性,使結(jié)合的SDS所帶負(fù)電荷不能完全掩蓋蛋白本身所帶電荷,導(dǎo)致電泳時(shí)遷移變慢。在表達(dá)Spyligase蛋白時(shí),本研究在其基因序列前插入了Cherry標(biāo)簽,目的蛋白的表達(dá)可以通過觀察菌體呈現(xiàn)的顏色進(jìn)行鑒別,當(dāng)菌體顏色為紅色時(shí)說明目的蛋白獲得了表達(dá),使檢測(cè)更為簡單方便。低溫誘導(dǎo)可以增加目的蛋白的可溶性,故我們?cè)谡T導(dǎo)表達(dá)中設(shè)置了25 ℃和18 ℃兩個(gè)溫度,分析發(fā)現(xiàn)25 ℃時(shí)重組蛋白的表達(dá)量更高,分析原因可能是在18 ℃低溫條件下細(xì)胞增殖緩慢。雖然18 ℃低溫可以促進(jìn)蛋白正確折疊,提高可溶性,但是目的蛋白的總表達(dá)量降低了,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇25 ℃進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中用的IPTG終濃度為0.5 mmol/L,考慮到IPTG可能存在的副作用,在實(shí)驗(yàn)中分別設(shè)計(jì)了高劑量組0.8 mmol/L和低劑量組0.2 mmol/L,發(fā)現(xiàn)在不同濃度處理間誘導(dǎo)效果存在差異,高劑量的IPTG組蛋白表達(dá)量降低,0.2 mmol/L和0.5 mmol/L間差異不大,可能是由于IPTG本身具有一定毒性，不易被細(xì)菌代謝[22],而高劑量IPTG會(huì)抑制細(xì)胞增殖,使蛋白表達(dá)量降低,最終His6-ArsC-H5HA10融合蛋白采用 0.5 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。His6-Cherry-Spyligase融合蛋白經(jīng)0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá),且目的蛋白主要在上清中,兩種蛋白均為可溶性表達(dá)。在目的蛋白序列中前引入了His6標(biāo)簽[23],目的是方便利用Ni-NTA純化技術(shù)[24], 最終通過親和純化得到目的蛋白。在PCT緩沖液中, Spyligase和Spy-H5HA10充分反應(yīng),通過SDS-PAGE電泳檢測(cè)其環(huán)化形成了環(huán)化單體、三聚體、六聚體以及九聚體,形成的多聚體均為單體分子量的3倍。本研究構(gòu)建的Spyligase和Spy-H5HA10原核表達(dá)載體,通過促溶標(biāo)簽均提高了目的蛋白的可溶性表達(dá)水平,避免了包涵體的變性和復(fù)性處理,添加了His6標(biāo)簽,便于后期重組蛋白的分離純化。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了Spyligase環(huán)化技術(shù)在H5HA10蛋白的可用性,在體外環(huán)境下合成了H5HA10蛋白環(huán)化單體、三聚體、六聚體以及九聚體等,為后續(xù)多聚體抗原應(yīng)用于禽流感基因工程疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。