張廣潤 ，邵菲菲 ，楊 譯 ，郭天康 ，田利民

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

骨質(zhì)疏松（osteoporosis，OP）是由于骨量減少、骨顯微結(jié)構(gòu)退化，導(dǎo)致骨脆性增加以及容易發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病[1]。唑來膦酸（ZA）作為第三代二膦酸鹽，可以阻止骨流失，增加骨量，效果是前兩代二膦酸鹽的100～850倍[2]。眾多研究發(fā)現(xiàn)，唑來膦酸不僅對(duì)破骨細(xì)胞發(fā)揮作用，其在改變成骨細(xì)胞的增殖與分化過程中同樣扮演著重要角色。Runx2是成骨細(xì)胞分化和骨形成過程中最早出現(xiàn)且最具特異性的轉(zhuǎn)錄因子[3]，而Osterix（Osx）是繼Runx2之后發(fā)現(xiàn)的成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，作為Runx2的下游基因在骨形成方面發(fā)揮重要作用[4]。本實(shí)驗(yàn)研究第三代二膦酸鹽唑來膦酸對(duì)小鼠MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響以及與成骨分化有重要關(guān)系的 Runx2、Osterix的表達(dá)情況，探究唑來膦酸引起骨量增加的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

小鼠前成骨細(xì)胞（MC3T3-E1細(xì)胞），購自中橋新舟生物有限公司。

1.2 試劑和儀器

DMEM/low glu培養(yǎng)基（Hyclone，美國）；胎牛血清，胰蛋白酶（Gibco，美國）；Runx2、Osterix和 GAPDH 抗體（ABCAM，美國），ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，CCK-8試劑盒，青鏈霉素混合液（100 X）（Solarbio，北京），Trizol試劑盒（Invitrogen，美國）；唑來膦酸（恒瑞醫(yī)藥，江蘇），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，qRT-PCR試劑盒（Promega）；5%二氧化碳培養(yǎng)箱（MCO-18AIC，日本）；超凈工作臺(tái)（Heal force）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI，美國），Gel DocTM XR+凝膠成像儀（BIO-RAD，美國）；熒光倒置顯微鏡（Olympus，日本）；酶標(biāo)儀（BIO-TEK，美國）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 將MC3T3-E1細(xì)胞株培養(yǎng)于DMEM/low glu培養(yǎng)基（含100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素）中，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)5%CO2、37℃常規(guī)培養(yǎng)，2 d換液一次，3～4 d傳代一次，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2實(shí)驗(yàn)藥物的制備 將唑來膦酸粉末溶于PBS中，制成濃度為10-2mol/L的儲(chǔ)備液，保存在-20℃冰箱中，使用時(shí)用DMEM/low glu培養(yǎng)基稀釋成濃度為10-3mol/L、10-8mol/L的培養(yǎng)基。

1.3.3四唑藍(lán)比色試驗(yàn)（MTT）檢測MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性調(diào)整MC3T3-E1細(xì)胞密度為1.5×104/ml，培養(yǎng)24 h后，更換新鮮培養(yǎng)液，分別加入不同濃度（10-3mol/L、10-8mol/L）的唑來膦酸溶液及生理鹽水（10 μl/孔），每種質(zhì)量濃度平行做6份。添加24、48、72、96 h 后各培養(yǎng)孔用 PBS洗一遍，每孔加 100 μl DMEM/low glu培養(yǎng)液，同時(shí)加入10 μl 10.5%的四甲基偶氮唑藍(lán)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加 100 μl DMSO，振蕩 10 min，在酶標(biāo)儀上測定波長490 nm處的吸光度（A）。

1.3.4 qRT-PCR檢測基因的表達(dá) 將MC3T3-E1細(xì)胞以1×105/ml的密度接種于6孔板上，24 h后更換培養(yǎng)液，加入兩種濃度（10-3mol/L、10-8mol/L）的唑來膦酸溶液處理，培養(yǎng)72 h后，每孔加入1 ml Trizol，提取總RNA。按照promega A5000 GoScript TM試劑盒說明書將 mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用 promega A5000 GoScript TM試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)（引物序列見表1），檢測Runx2、Osterix基因表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)步驟：第一步：95℃預(yù)變性2 min；第二步：95℃變性15 s，60℃退火+延伸60 s，共40 個(gè)循環(huán)；第三步：繪制熔解曲線（Dissociation），以 β-actin為內(nèi)參，使用2-△△CT法計(jì)算相對(duì)定量。

1.3.5 Western Bloting檢測蛋白表達(dá)水平 MC3T3-E1細(xì)胞以1×105/ml密度接種于6孔板，24 h后更換培養(yǎng)液，分別以兩種濃度的唑來膦酸處理，培養(yǎng)3 d后，用PBS洗3遍，加入細(xì)胞裂解液后4℃條件下裂解30 min，800 x離心5 min；每孔加入RIPA裂解液100 μl，按1∶100的比例于裂解液中加入蛋白酶抑制劑（PMSF）。利用BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度，并將相同量的蛋白質(zhì)加入PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至膜上。室溫下，在脫色搖床上搖動(dòng)封閉1 h，分別用兔抗鼠Runx2、Osterix一抗孵育，4℃過夜，第二天 TBST洗3遍，每次10 min。二抗孵育2 h，底物化學(xué)發(fā)光ECL顯色，Gel DocTM XR+凝膠成像儀曝光后進(jìn)行圖像分析。

表1 RT-PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 唑來膦酸對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響

使用MTT法檢測MC3T3-E1細(xì)胞增殖水平，可以看出，24 h時(shí)各組細(xì)胞OD值無顯著性差異，從48 h開始，高濃度組細(xì)胞增殖明顯受到抑制，與對(duì)照組比較差異具有顯著性（P＜0.05），而低濃度組OD值與對(duì)照組比較差異無顯著性（P＞0.05）。說明高濃度（10-3mol/L）ZA會(huì)明顯抑制成骨細(xì)胞增殖，低濃度（10-8mol/L）ZA則不影響成骨細(xì)胞增殖（見表2）。

表2 唑來膦酸作用下MC3T3-E1細(xì)胞OD值變化（x±s）

2.2 唑來膦酸對(duì)Runx2、Osterix基因表達(dá)水平的影響

圖1 唑來膦酸對(duì)Runx2及Osterix基因表達(dá)水平的影響

圖2 唑來膦酸對(duì)Runx2及Osterix蛋白表達(dá)水平的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，72 h后，高濃度組Runx2基因表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低（P＜0.05），而低濃度組Runx2基因表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；高濃度組 Osterix基因表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低（P＜0.01），而低濃度組Osterix基因表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），見圖1。

2.3 唑來膦酸對(duì)Runx2、Osterix蛋白表達(dá)水平的影響

Western Blotting檢測結(jié)果顯示，高濃度組Runx2和Osterix蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低，但低濃度組Runx2及Osterix蛋白表達(dá)水平則明顯升高（P＜0.01），與對(duì)照組差異具有顯著性，見圖2。

3 討論

成骨細(xì)胞對(duì)骨形成至關(guān)重要，參與了骨基質(zhì)的合成、分泌及礦化。Runx2和Osterix是成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在骨發(fā)育的不同階段發(fā)揮重要作用。

唑來膦酸是作用較強(qiáng)的骨吸收抑制劑，通過阻斷甲羥戊酸通路抑制破骨細(xì)胞生成，促使破骨細(xì)胞凋亡，減少骨吸收，降低骨轉(zhuǎn)換，增加骨量[5]。研究表明，第二代二膦酸鹽對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化及礦化均有促進(jìn)作用，且濃度為10-8mol/L時(shí)效果最佳[6-7]，低濃度唑來膦酸對(duì)成骨細(xì)胞增殖幾乎沒有影響[8-9]，高于10-5mol/L濃度的唑來膦酸對(duì)成骨細(xì)胞增殖具有抑制作用[8]。

我們發(fā)現(xiàn)唑來膦酸在濃度10-3mol/L時(shí)對(duì)小鼠成骨細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，在濃度為10-8mol/L時(shí)對(duì)成骨細(xì)胞增殖幾乎不產(chǎn)生影響，且不隨時(shí)間變化發(fā)生改變。

Runx2是骨形成過程中最早和最具特征性的標(biāo)志[10-11]。Osterix是具有鋅指基序結(jié)構(gòu)域的成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子，僅在成骨細(xì)胞中特異性表達(dá)，存在于Runx2下游，基因序列中有Runx2結(jié)合位點(diǎn)，受其正向調(diào)控，主要在成骨分化晚期發(fā)揮作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度（10-8mol/L）ZA對(duì)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞沒有毒性，并且能調(diào)節(jié)與成骨細(xì)胞分化相關(guān)的Runx2、Osterix的基因及蛋白表達(dá)水平，與之前的研究結(jié)果相似[13-14]，高濃度ZA能抑制其表達(dá)，阻止成骨細(xì)胞分化。

本研究為研究唑來膦酸對(duì)成骨細(xì)胞的作用機(jī)制提供了依據(jù)，但尚未進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞水平無法準(zhǔn)確模擬體內(nèi)釋放唑來膦酸的生理過程和藥物劑量，還需要通過動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。