常 艷， 童方念， 程茗慧， 張效林

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110016

對(duì)氧磷酶(paraoxonase，PON)家族主要由PON1、PON2、PON3組成，PON1主要由肝合成并存于血漿中[1]。PON1與血清中高密度脂蛋白代謝的關(guān)系密切，PON1的遺傳多態(tài)性改變與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)生、發(fā)展存在相關(guān)性[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，PON1血清學(xué)活性與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，PON1多與血清高密度脂蛋白結(jié)合，在血清中抑制低密度脂蛋白發(fā)生氧化反應(yīng)，降低體內(nèi)的氧化型低密度脂蛋白的表達(dá)水平，破壞氧化型低密度脂蛋白中有細(xì)胞毒性的溶血磷脂的活性，從而抵抗冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)生，PON1血清學(xué)表達(dá)水平與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)生呈正相關(guān)[3-4]。急性心肌梗死是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊破裂繼發(fā)冠狀動(dòng)脈內(nèi)血栓，導(dǎo)致血栓梗塞相應(yīng)的部位發(fā)生心肌壞死。有研究表明，PON1 rs662(Q192R)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)會(huì)改變PON的活性，與經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)后氯吡格雷的低反應(yīng)性和支架術(shù)后血栓的形成存在相關(guān)性[5-6]。目前，PON1活性改變是否與急性心肌梗死的發(fā)生存在相關(guān)性尚不明確，需要進(jìn)一步證實(shí)[7-8]。本研究旨在探討PON1基因單核苷酸多態(tài)性與急性心肌梗死發(fā)生的相關(guān)性。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取自2015年2月至2017年6月北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院收治的急性心肌梗死患者納入A組，同時(shí),選取同期因胸痛入院但冠狀動(dòng)脈造影為陰性的患者納入B組，每組各326例。急性心肌梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)：心電圖出現(xiàn)動(dòng)態(tài)演變過(guò)程，至少兩個(gè)肢體導(dǎo)聯(lián)ST段抬高≥0.1 mV，或胸導(dǎo)聯(lián)≥0.2 mV，或新發(fā)的左束支傳導(dǎo)阻滯；心肌損傷標(biāo)志物異常升高，超過(guò)正常參考值上限的99%；持續(xù)30 min以上的典型胸痛癥狀；血清心肌損傷標(biāo)志物動(dòng)態(tài)變化。排除標(biāo)準(zhǔn)：病毒性心肌炎、肝功能不全、腦卒中的急性期；服用糖皮質(zhì)激素、類固醇類抗炎藥或免疫抑制劑患者；肺部感染、發(fā)熱；炎癥性腸病、風(fēng)濕性疾病、各類自身免疫性疾?。谎合到y(tǒng)疾病、血液透析治療的腎功能不全者；嚴(yán)重的心力衰竭、血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定者；造血系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法 DNA提取試劑盒(北京天根生物試劑有限公司生產(chǎn))提取兩組外周血的基因組DNA。兩組均在空腹?fàn)顟B(tài)收集抽取外周靜脈血5 ml，抗凝管(乙二胺四乙酸二鈉)中靜置5 min，-70℃下保存[9]。采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增兩組的基因組DNA。應(yīng)用Primer 5.0軟件獲取PON1-108A/G單核苷酸多態(tài)片段的引物，上游引物： 5′-ATCAGCTTCGCCATGGTCGT-3′，下游引物：5′-CTCTCTTTACAGTTGGAAGG-3′。PCR擴(kuò)增在25 μl反應(yīng)體系中進(jìn)行，其中基因組DNA 1 μl，10×PCR緩沖液2.5 μl，dNTP 2.0 μl，上游和下游引物各10 pmol，rTaq酶3 U，去離子水加至25 μl。通過(guò)熱循環(huán)儀完成PCR擴(kuò)增反應(yīng)(美國(guó)BIO-RAD公司)。熱循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性3 min；以94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s的順序反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min；PCR片段長(zhǎng)度為265 bp。吸取PCR產(chǎn)物5 μl，加入6倍稀釋的電泳上樣緩沖液，2%瓊脂糖凝膠下電泳，電壓設(shè)定100 V，電泳時(shí)間45 min。對(duì)PCR擴(kuò)增的檢測(cè)樣品進(jìn)行測(cè)序檢樣(上海生物工程技術(shù)有限公司)。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的一般資料比較 A組吸煙、高血壓患者的比例明顯高于B組，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A組血清中低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)的表達(dá)水平明顯高于B組，而血清高密度脂蛋白(high-density lipoproteincholesterol，HDL-C)的表達(dá)明顯低于B組，組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者的臨床資料比較

2.2 基因型分析 PON1-108A/G單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)存在3種基因型，分別為AA型、AG型和GG型，PON1-108A/G片段PCR擴(kuò)增片段大小為265 bp。PON1基因-108A/G單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律。PON1-108A/G單核苷酸位點(diǎn)的3種基因型AA型、AG型和GG型在A組的分布頻率為34.0%、42.9%和23.1%，在B組的分布頻率分別為27.0%、43.6%和29.4%；PON1基因-108A/G單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)A和G等位基因在A組的分布頻率為55.5%和44.5%，在B組的分布頻率為51.2%和48.8%(P=0.01；比值比=1.31；95%可信區(qū)間為1.05～1.63)。Logistic多元回歸分析結(jié)果顯示，PON1基因-108A/G單核苷酸多態(tài)G等位基因是急性心肌梗死發(fā)病的危險(xiǎn)因素。

3 討論

急性心肌梗死是在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變的基礎(chǔ)上，冠狀動(dòng)脈血管壁的炎癥負(fù)荷、脂質(zhì)負(fù)荷持續(xù)加重，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定型斑塊破裂，繼發(fā)了冠狀動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊內(nèi)炎性因子的激活，引起血液中的血小板及纖維蛋白原活化，繼發(fā)冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)血栓形成，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的破裂，釋放相應(yīng)的斑塊內(nèi)容物[1-2]。PON1通過(guò)對(duì)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)以防止冠狀動(dòng)脈內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬脂肪顆粒，遏制動(dòng)脈粥樣硬化反應(yīng)速度[10]。本研究結(jié)果顯示，兩組在PON1基因-108 A/G單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)GG等位基因分布頻率方面比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，G等位基因可作為預(yù)測(cè)急性心肌梗死發(fā)生的危險(xiǎn)因素。PON1基因-108A/G單核苷酸多態(tài)位于PON1基因啟動(dòng)子區(qū)域的-108位點(diǎn)，其核苷酸位點(diǎn)由A到G改變，引起PON1基因啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的改變，從而引起PON1蛋白表達(dá)翻譯水平的變化。在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊破裂的過(guò)程中，冠狀動(dòng)脈血管壁氧化應(yīng)激反應(yīng)加重，使冠狀動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的炎性反應(yīng)加重，造成冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊的破裂和出血，繼發(fā)冠狀動(dòng)脈內(nèi)血栓的形成[1]。本研究為回顧性分析，尚不能對(duì)其因果關(guān)系給予充分的肯定。

綜上所述，PON1-108 A/G單核苷酸多態(tài)位于基因啟動(dòng)子區(qū)-108位點(diǎn)，該堿基位置A變成G可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子與基因的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生變化[9]，PON1-108A/G等位基因可能是急性心肌梗死發(fā)病的危險(xiǎn)因素，PON1-108A/G等位基因的改變對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的形成具有重要影響。