陳茵茵 蘇妙貞 梁穎思

（廣東省食品檢驗所 廣東廣州 510000）

1 前言

單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria Monocytogenes,簡稱“單增李斯特菌”）為革蘭陽性無芽孢桿菌，是一種重要的人畜共患的病原菌[1，2]，廣泛存在于自然界中，可以通過各種傳播途徑進(jìn)行擴散。人和動物感染后可導(dǎo)致腦膜炎、腦炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎、膿腫和局部的膿性損傷等，孕婦感染后可造成流產(chǎn)、死胎等疾病，發(fā)病者病死率高達(dá)30%～70%[3-7]。近年來，因食品污染單增李斯特菌而導(dǎo)致的食物中毒事件日漸增多，已引起不少國家的廣泛關(guān)注，并已被列為20世紀(jì)90年代四大食品致病菌之一[8-10]。2015年美國食品監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，單增李斯特菌感染發(fā)病住院率高達(dá)95.70%，病死率達(dá)12.93%[11，12]。我國食源性疾病監(jiān)測顯示，國內(nèi)人感染單增李斯特菌散發(fā)報告數(shù)逐年上升，2016年，全國報告82例病例，以孕婦和新生兒為主[13]。相關(guān)報告已經(jīng)證實肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等是李斯特菌的感染源[14]。因而，提高食品中單增李斯特菌的檢出率和準(zhǔn)確率，是食品檢驗檢測機構(gòu)重要的能力建設(shè)。

能力驗證是評定和監(jiān)督實驗室和檢查機構(gòu)技術(shù)能力的重要方式之一，對實驗室和檢查機構(gòu)是一種有效的外部質(zhì)量保證活動，也是內(nèi)部質(zhì)量控制技術(shù)的補充[15]。通過能力驗證，特別是國際間的能力比對，更能有效評價實驗室的檢驗檢測能力。通過能力驗證結(jié)果，可以充分認(rèn)識到實驗室檢驗?zāi)芰Φ牟蛔愫驮趪H中的差距，不斷地改進(jìn)和提升實驗室檢驗檢測能力。

本實驗室承擔(dān)廣東省各類食品致病菌檢測任務(wù)，對單增李斯特菌等致病菌的檢測關(guān)系到食品安全和人們的生活健康。2018年，本實驗室參加了由英國FAPAS分析實驗室組織的國際性單增李斯特菌及李斯特菌屬的定性能力驗證比對活動。通過探討食品中單增李斯特菌檢測的能力驗證過程，為提升實驗室各類食源性微生物的檢測能力、獲得滿意的能力驗證結(jié)果提供重要的參考依據(jù)。

2 材料和方法

2.1 樣品

由英國FAPAS分析實驗室提供，樣品編號為M229d02，內(nèi)含2個待測樣品，內(nèi)部自行編號為M229d02-A，M229d02-B。

2.2 試劑

緩沖蛋白胨水（BPW）、李氏增菌肉湯 LB（LB1，LB2）、1%鹽酸吖啶黃（acriflavineHCl）溶液、1%萘啶酮酸鈉鹽（naladixicacid）溶液、PALCAM 瓊脂、李斯特菌屬顯色培養(yǎng)基，以上試劑購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；革蘭氏染液、5%～8%羊血瓊脂、過氧化氫試劑、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂(TSAYE)、單增李斯特菌生化鑒定盒（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；VITEK生化鑒定系統(tǒng)試劑、革蘭氏陽性細(xì)菌鑒定卡（簡稱GP卡）、VIDAS單增李斯特菌Ⅱ生化鑒定試劑盒、API李斯特菌屬鑒定試劑盒（比色法），購自法國梅里埃生物有限公司；BAX生化鑒定試劑條,購自美國杜邦公司。

2.3 菌種

單增李斯特菌ATCC19111、英諾克李斯特菌（Listeria innocua，簡稱“英諾克”）ATCC33090、伊氏李斯特菌（Listeria ivanovii，簡稱“伊氏”）ATCC19119、斯氏李斯特菌（Listeria seeligeri，簡稱“斯氏”）CICC 21671、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）ATCC25923、馬紅球菌（Rhodococcus equi）ATCC6939，以上菌種購自國家食品安全菌種保藏中心。

2.4 儀器

生物安全柜（賽默飛世爾公司），生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），顯微鏡（卡爾蔡司），高壓滅菌鍋(日本TOMY公司),VITEK 2compact全自動微生物快速檢測分析系統(tǒng)(法國梅里埃公司)，BAX System Q7全自動病原微生物快速檢測系統(tǒng)(美國杜邦公司)，NEW ATB細(xì)菌鑒定/藥物敏感試驗系統(tǒng)（法國梅里埃公司）、Mini-VIDAS全自動酶聯(lián)免疫分析儀(法國梅里埃公司)。

2.5 方法

依據(jù)英國FAPAS分析實驗室提供的能力驗證說明書，GB 4789.30—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗單核細(xì)胞增生李斯特菌檢驗》[16]進(jìn)行基礎(chǔ)檢驗和生化分析，利用mini-VIDAS全自動酶聯(lián)熒光免疫系統(tǒng)、VITEK 2compact全自動微生物快速檢測分析系統(tǒng)、NEW ATB細(xì)菌鑒定/藥物敏感試驗、BAX System Q7全自動病原微生物快速檢測進(jìn)行篩選和鑒定。

3 實驗過程及結(jié)果

3.1 樣品處理

開啟凍干樣品瓶蓋后，用（20±0.2）mL BPW水化樣品，水化過程中輕柔震蕩樣品數(shù)次，水化完成后，將溶液吸出轉(zhuǎn)移至無菌錐形瓶中，室溫下放置樣品（30±2） min，然后進(jìn)行測試。

3.2 增菌

將水化后的樣品M229d02-A、M229d02-B分別轉(zhuǎn)移至225 mL李氏增菌肉湯LB1中，充分混勻，放置（30±1）℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（24±2） h。同時分別吸取1 mL 1個麥?zhǔn)蠞岫鹊膯卧隼钏固鼐⒂⒅Z克、伊氏、斯氏懸濁液至225 mL李氏增菌肉湯LB1中，作為質(zhì)量控制陽性對照實驗和樣品一同增菌培養(yǎng)。24h后，分別移取0.1 mL李氏增菌肉湯LB1至10 mL李氏增菌肉湯LB2中，充分混勻，放置（30±1）℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（24±2） h。

3.3 分離培養(yǎng)

使用10 μL的接種環(huán)分別取LB2二次增菌液劃線接種于李斯特菌屬顯色平板和PALCAM瓊脂平板上,于（36±1）℃ 培養(yǎng) 24～48 h, 觀察各個平板上生長的菌落形態(tài)。增菌和分離培養(yǎng)培養(yǎng)結(jié)果如表1所示。

(5)2018年6月，在四川工商學(xué)院大創(chuàng)中心路演廳舉辦了2018年云創(chuàng)之聲創(chuàng)新項目孵化大賽，共有52個項目進(jìn)入初賽行業(yè)，最終角逐出6個優(yōu)質(zhì)項目；

3.4 純化

自分離平板上分別挑取典型菌落在TSA-YE平板上劃線，于（36±1）℃培養(yǎng) 18～24 h。

表1 增菌和分離培養(yǎng)結(jié)果

3.5 鑒定

3.5.1國標(biāo)法鑒定結(jié)果

國標(biāo)法GB 4789.30—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗單核細(xì)胞增生李斯特菌檢驗》鑒定，鑒定結(jié)果如表2所示。

表2 國標(biāo)法鑒定結(jié)果

3.5.2 mini-VIDAS全自動酶聯(lián)熒光免疫系統(tǒng)鑒定結(jié)果

表3 mini-VIDAS全自動酶聯(lián)熒光免疫系統(tǒng)鑒定結(jié)果

3.5.3 VITEK 2compact全自動微生物快速檢測分析系統(tǒng)鑒定結(jié)果

分別挑取樣品M229d02-A、M229d02-B在李斯特菌屬顯色平板和PALCAM瓊脂平板上的典型菌落通過TSA-YE平板分純后的菌落，制成3 mL比濁度在0.5～0.6 JTU的菌液，插上GP卡，編制VITEK 2compact全自動微生物快速檢測分析系統(tǒng)程序進(jìn)行檢測，同時使用單增、伊氏標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽性對照。結(jié)果如表4所示。

表4 VITEK 2compact全自動微生物快速檢測分析系統(tǒng)鑒定結(jié)果樣品

3.5.4 NEW ATB細(xì)菌鑒定/藥物敏感試驗系統(tǒng)鑒定結(jié)果

根據(jù)梅里埃公司API李斯特菌屬鑒定試劑盒（比色法）使用說明，對樣品M229d02-A、M229d02-B在李斯特菌顯色平板和PALCAM瓊脂平板上的典型菌落通過TSA-YE平板分純后的菌落進(jìn)行鑒定，同時使用單增李斯特菌、伊氏標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽性對照，鑒定結(jié)果如表5所示。

3.5.5 BAX System Q7全自動病原微生物快速檢測鑒定結(jié)果

表5 NEW ATB細(xì)菌鑒定/藥物敏感試驗系統(tǒng)鑒定結(jié)果

依據(jù)美國杜邦公司的單核細(xì)胞增生李斯特菌BAX生化鑒定試劑盒以及BAX System Q7全自動病原微生物快速檢測系統(tǒng)的操作說明，對樣品M229d02-A、M229d02-B進(jìn)行生化鑒定，同時使用單增李斯特菌、伊氏標(biāo)準(zhǔn)菌株的LB1增菌液作為陽性對照，鑒定結(jié)果如表6所示。

表6 BAX System Q7全自動病原微生物快速檢測鑒定結(jié)果

3.6 結(jié)果

通過國標(biāo)法檢測和鑒定，結(jié)合4種先進(jìn)的全自動鑒定方法，可以判定樣品M229d02-A檢出單核細(xì)胞增生李斯特菌，同時檢出李斯特菌屬，樣品M229d02-B未檢出單增李斯特菌，檢出李斯特菌屬（伊氏），和英國FAPAS分析實驗室公布的結(jié)果一致，本實驗室的國際性能力驗證取得滿意的結(jié)果。

4 討論

在本次能力驗證試驗中，使用國標(biāo)法進(jìn)行初步增菌時，樣品M229d02-B出現(xiàn)了LB2不渾濁生長，PALCAM培養(yǎng)基和李斯特菌屬顯色培養(yǎng)基均無菌落生長。當(dāng)將樣品M229d02-B的LB2增菌液延長培養(yǎng)24 h后，再次劃線分離，PALCAM培養(yǎng)基和李斯特菌屬顯色培養(yǎng)基均有典型菌落生長。表明李斯特菌屬具有緩慢生長的特點，如果依據(jù)第1次增菌培養(yǎng)及分離培養(yǎng)情況來判定結(jié)果，很有可能會導(dǎo)致結(jié)果誤判。

PALCAM培養(yǎng)基不能有效區(qū)分單增李斯特菌和其他李斯特菌。因為所有類型的李斯特菌均含有β-D-葡萄糖苷酶，這種酶能裂解培養(yǎng)基中的七葉靈，產(chǎn)生灰綠色菌落，然后通過降解產(chǎn)物七葉苷原與鐵離子反應(yīng)，在所有種類的李斯特菌菌落周圍能產(chǎn)生棕黑色暈圈[17]。而在李斯特菌屬顯色培養(yǎng)基中，單增李斯特菌和伊氏均有相似的菌落形態(tài)和不透明白色暈圈，也不能較好地使用李斯特菌屬顯色培養(yǎng)基區(qū)分這兩種菌，需要結(jié)合下一步的驗證實驗才能區(qū)分開來。因此，通過選擇性分離培養(yǎng)，只能較好地區(qū)分李斯特菌和非李斯特菌，不能區(qū)分李斯特菌的種類分型，必須結(jié)合后續(xù)的驗證實驗，才能更好地做出結(jié)論判定。

在其他4種先進(jìn)的鑒定方法中，BAX System Q7出現(xiàn)了結(jié)果無效的情況。就結(jié)果偏差分析，BAX System Q7全自動病原微生物快速檢測是采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù),在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法[18-23]。LB2增菌液中添加了熒光染料吖啶黃素，而LB2增菌液中添加吖啶黃素的濃度是LB1增菌液中濃度的近2倍，過量的吖啶黃素及培養(yǎng)時間的延長會干擾檢測過程中的熒光信號，使讀取的結(jié)果發(fā)生偏差。因此，為減少結(jié)果發(fā)生偏差，要確認(rèn)使用的增菌液是否含有干擾檢測的熒光化學(xué)成分，建議取經(jīng)過TSA-YE純化的菌落或挑取選擇平板上的可疑菌落進(jìn)行增菌檢測。

國標(biāo)方法是檢驗檢測領(lǐng)域傳統(tǒng)的常規(guī)的檢驗方法，雖然檢測時間長，操作步驟煩瑣，但其具有穩(wěn)定、準(zhǔn)確的優(yōu)點，并且通過檢測后可以獲得純化的目標(biāo)菌供后續(xù)研究，所以截至目前，世界上很多國家仍將常規(guī)培養(yǎng)檢測方法列為食品微生物檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[24]。隨著微生物學(xué)的發(fā)展，各種快速檢測方法興起，并廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域，如免疫學(xué)方法和PCR方法[25，26]，雖然具有簡單、靈敏、快速的優(yōu)點，但影響檢測結(jié)果的干擾因素也增加，如增菌液的化學(xué)成分、目標(biāo)微生物的純度等，增加結(jié)果不定性概率。因此，在檢驗檢測中，可以通過傳統(tǒng)的檢驗方法和先進(jìn)的快速檢測方法相結(jié)合，利用快速檢測方法對目標(biāo)微生物進(jìn)行篩選，得到初步結(jié)果，縮短檢測時間，然后利用傳統(tǒng)基礎(chǔ)的方法，進(jìn)行下一步的確證實驗[27]。這樣在提高檢測效率的同時，也確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

單一的能力驗證，可以有效地驗證該項目的檢測能力，同時也有效地驗證了檢驗檢測實驗室在某些檢驗檢測領(lǐng)域的技術(shù)能力及各類傳統(tǒng)或先進(jìn)的檢測技術(shù)的有效應(yīng)用。正如此次的單增李斯特菌國際性能力驗證，不僅驗證實驗室在單增李斯特菌的檢驗檢測能力，也有效地評價實驗室在運用免疫學(xué)、PCR等先進(jìn)的快速檢驗檢測技術(shù)的能力。通過實驗，識別技術(shù)運用上的不足之處，通過分析，尋找解決問題的方法和對策，從而積累經(jīng)驗，提高檢驗檢測能力。