張文 徐立蒲 呂曉楠 王小亮 王 姝 王靜波 曹歡

（北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站 北京 100176）

1 前言

錦鯉（Cyprinus Carpio Var Koi）是我國主要觀賞魚養(yǎng)殖品種之一，在觀賞魚國際貿(mào)易中占較大比重，具有重要的經(jīng)濟價值[1-3]。隨著我國錦鯉養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，疫病的頻繁出現(xiàn)也制約了觀賞魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。錦鯉對多種病原易感，據(jù)研究可引起錦鯉大面積死亡的主要病原是鯉浮腫病毒（Carp Edema Virus，CEV）和錦鯉皰疹病毒（Kio Herpes Virus，KHV）[4]。CEV是大小約為200nm×400nm的雙鏈DNA，屬痘病毒[5]。KHV是直徑167～200 nm的雙鏈DNA，屬皰疹病毒[6，7]。這2種病毒引起的癥狀極其相似，包括爛鰓、眼球凹陷等，死亡率高達(dá)80%～100%[8，9]。因此，當(dāng)養(yǎng)殖錦鯉出現(xiàn)爛鰓、凹眼等癥狀，并有較高死亡率時，根據(jù)現(xiàn)場調(diào)查癥狀和流行特點很難區(qū)分這2種病毒病，還需盡快進(jìn)行實驗室檢測。分子生物學(xué)方法是實驗室最常用的檢測CEV和KHV 的方法。對于CEV，Oyamatsu等[10]建立了nest-PCR方法，該方法適合于錦鯉的檢測[11]。對于KHV、PCR檢測方法是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）水生動物疾病診斷手冊上優(yōu)先推薦的方法。目前，實驗室通常采用SC/T 7212.1—2011《鯉皰疹病毒檢測方法第1部分：錦鯉皰疹病毒》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)同時擴增TK基因和 Sph基因來檢測該病毒[12，13]。

鑒于CEV和KHV引起的發(fā)病錦鯉癥狀極其相似，針對同一臨床樣品需要分別檢測CEV和KHV這2種病原，為提高實驗室檢測效率，盡快確診病原，本研究建立了可同時檢測錦鯉樣品中CEV和KHV的三重PCR檢測方法，為鯉浮腫病毒病（CEVD）和錦鯉皰疹病毒?。↘HVD）這2種常見魚類疫病的快速診斷及有效防控提供必要的技術(shù)支持。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 毒株

CEV、KHV、金魚造血器官壞死病毒（Goldfish Haematopoietic Necrosis Virus，GFHNV）、 流行性造血器官壞死病毒（Epizootic Haematopoietic Necrosis Virus，EHNV）、蛙虹彩病毒（Bohle Iridovirus Virus，BIV）、斑點叉尾鮰病毒 （Channel Catfish Virus，CCV）（由北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站鑒定保存）、白斑綜合征病毒 （White Spot Syndrome Virus，WSSV）、蝦肝腸胞蟲 （Enterocytozoon Hepato Penaei，EHP）（購自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所）。

2.1.2 主要試劑與儀器

DNA抽提試劑盒（QIAGEN公司）；DNA擴增試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）；梯度PCR儀（Life Technologies公司）。

2.2 方法

2.2.1 引物的選擇與合成

根據(jù)Oyamatsu等建立的nest-PCR方法和錦鯉皰疹病毒行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T 7212.1—2011《鯉皰疹病毒檢測方法 第1部分：錦鯉皰疹病毒》公布的方法，選擇擴增CEV P4a基因548 bp片段、KHV TK基因409 bp片段和KHV Sph基因292 bp片段的3對特異性引物，引物序列見表1，由北京六合華大基因科技有限公司合成。

表1 引物序列

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

參照DNA抽提試劑盒說明書，提取鯉浮腫病毒和錦鯉皰疹病毒的DNA，送至北京天成新脈生物技術(shù)有限公司，合成CEV P4a基因序列（548 bp），克隆到pEASY-T1載體。合成KHV TK基因序列（409 bp）和 KHV Sph 基因序列（292 bp），克隆到PUC57-Kan載體上，構(gòu)建CEV-P4a、KHV-TK和KHV-Sph標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，根據(jù)質(zhì)粒濃度計算拷貝數(shù)。

2.2.3 三重PCR退火溫度及引物濃度優(yōu)化

參照DNA擴增試劑盒說明書，單重PCR擴增反應(yīng)的反應(yīng)體系見表2，反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性4 min，95℃變性 1 min， 適宜溫度退火 1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)后72℃延伸10 min。

表2 單重PCR反應(yīng)體系

在單重PCR反應(yīng)條件基礎(chǔ)上，分別加入質(zhì)粒CEV-P4a、KHV-TK和KHV-Sph各2.5μL作為模板，退火溫度設(shè)置為 43℃、45℃、47℃、49℃、51℃、53℃、55℃、57℃、59℃、61℃、63℃、65℃進(jìn)行三重 PCR 擴增，根據(jù)條帶強弱確定最佳退火溫度。在此基礎(chǔ)上，設(shè) 置 每 對 引 物 終 濃 度 為 0.1 μmol/L、0.2 μmol/L、0.3 μmol/L、0.4 μmol/L、0.5 μmol/L、0.6 μmol/L 6 個梯度，組合后分別進(jìn)行三重PCR擴增，根據(jù)條帶強弱、有無雜帶確定最佳引物終濃度。

2.2.4 敏感性試驗

對質(zhì)粒 CEV P4a、KHV TK和KHV Sph分別進(jìn)行10倍系列稀釋，按照2.2.3所述的方法進(jìn)行單重和三重PCR擴增，驗證檢測方法的敏感性。

2.2.5 特異性試驗

分別以質(zhì)粒 CEV-P4a、KHV-TK和 KHV-Sph作為模板，同時加入3對特異性引物，按照優(yōu)化好的反應(yīng)條件進(jìn)行三重單檢PCR擴增，驗證引物間是否存在交叉反應(yīng)。同時采用建立的方法，對GFHNV、EHNV、CCV等DNA病毒進(jìn)行特異性驗證。

2.2.6 臨床樣品檢測應(yīng)用

采用本研究建立的三重PCR方法，檢測本實驗室鑒定保存的20份樣品，評價該方法的可靠性。

3 結(jié)果

3.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過設(shè)置不同退火溫度進(jìn)行三重PCR擴增，可知退火溫度為53℃，目的條帶最清晰且背景干凈，見圖1。設(shè)置不同引物終濃度進(jìn)行三重PCR擴增，結(jié)果顯示，當(dāng)引物終濃度均為0.3 μmol/L時，目的條帶最明顯。因此，優(yōu)化好的反應(yīng)體系為：2×Master Mix 25 μL，3 對特異性引物終濃度 0.3 μmol/L，模板2.5μL，補水至50μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性4 min，95℃變性1min，53℃退火 1min，72℃延伸 1min，35 個循環(huán)后72℃延伸10 min。

圖1 不同退火溫度的擴增結(jié)果

3.2 敏感性試驗結(jié)果

以10倍系列稀釋的質(zhì)粒CEV-P4a、KHV-TK和KHV-Sph作為模板，分別進(jìn)行單重PCR檢測,結(jié)果顯示 3種質(zhì)粒的檢測限分別為 300 copies/μL、30 copies/μL、30 copies/μL，見圖 2；進(jìn)行三重 PCR 檢測，結(jié)果顯示3種質(zhì)粒的檢測限均為300 copies/μL，與單重PCR相比，KHV敏感性有所下降，見圖3。

3.3 特異性試驗結(jié)果

圖2 單重PCR敏感性試驗

圖3 三重PCR敏感性試驗

當(dāng)反應(yīng)體系中只加入CEV P4a、KHV TK和 KHV Sph中任意2種質(zhì)粒作為模板，采用本研究建立的方法進(jìn)行PCR擴增時，結(jié)果僅得到相應(yīng)模板的目的條帶，表明引物間沒有交叉反應(yīng)，見圖4。以GFHNV、EHNV、CCV等多種DNA病毒核酸作為模板進(jìn)行三重PCR擴增，結(jié)果均沒有目的條帶，見圖5。

3.4 臨床樣品檢測結(jié)果

圖4 任意2種質(zhì)粒作為模板三重PCR擴增

圖5 特異性試驗

采用本研究建立的三重PCR法，對實驗室鑒定保藏的20份錦鯉樣品進(jìn)行檢測，驗證方法的可靠性。其中有13份樣品經(jīng)英國環(huán)境、漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖科學(xué)中心（CEFAS）建立的熒光PCR鑒定為CEV陽性，7份樣品經(jīng)SC/T 7212.1—2011《鯉皰疹病毒檢測方法 第1部分：錦鯉皰疹病毒》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)鑒定為KHV陽性。三重PCR擴增結(jié)果顯示，13份CEV陽性樣品中，只有4份有548 bp目的條帶，參考日本學(xué)者Oyamatsu等建立的nest-PCR方法，采用該方法中的套式引物對其余9份樣品進(jìn)行套式擴增，結(jié)果均有180 bp目的條帶。雖然這9份樣品經(jīng)三重PCR擴增沒有548 bp目的條帶，但經(jīng)套式PCR可擴增出180 bp條帶，說明第一步可以擴增出微量的PCR產(chǎn)物，或產(chǎn)生了錯誤片段。7份KHV陽性樣品均能夠同時擴增出409 bp和292 bp 2條目的條帶，結(jié)果見表3。

表3 臨床樣品檢測結(jié)果

（續(xù)表3）

4 討論

KHVD是OIE必須申報的國家二類動物疫病，自2002年在我國大陸進(jìn)口的錦鯉中發(fā)現(xiàn)KHV至今，我國多地鯉（Cyprinus Carpio Linnaeus）及錦鯉養(yǎng)殖場均有KHV感染的報道，給我國鯉及錦鯉養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[14]。CEVD是2016年在我國首次被確診的可感染鯉和錦鯉臨床癥狀與KHVD極其相似的魚類病毒病[15-17]，死亡率在80%以上，已在我國多地爆發(fā)流行[18]，同樣制約了鯉及錦鯉養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，針對CEVD和KHVD尚沒有有效的治療措施，提高檢測效率，盡早確診病原，為疫病防控提供必要依據(jù)則具有重要意義。目前，還沒有篩選到能夠穩(wěn)定易感CEV的敏感細(xì)胞系，主要依靠PCR方法檢測CEV。有研究表明，Oyamatsu等和英國CEFAS建立的套式PCR都存在漏檢現(xiàn)象[19，20]，其中，Oyamatsu 建立的方法適用于錦鯉的檢測，而檢測鯉時有漏檢情況。英國CEFAS建立的實時熒光定量PCR是目前最適用于檢測CEV的方法，更適用于CEV的常規(guī)監(jiān)測。但是熒光PCR的擴增產(chǎn)物長度只有76 bp,測序后無法通過序列比對進(jìn)行相似性和同源性分析，導(dǎo)致相關(guān)數(shù)據(jù)缺失，且一般普通實驗室不具備該設(shè)備。針對KHV的敏感細(xì)胞系已有大量報道，但通常需要傳代3～5次，每次培養(yǎng)時間約為2周，分離培養(yǎng)時間較長，且首次分離成功的很少，故普通PCR檢測方法依然是診斷KHV首選。綜合考慮上述因素，本研究建立了針對錦鯉樣品可同時檢測CEV和KHV的三重PCR檢測方法。

目前，PCR技術(shù)因快速、靈敏、特異等特點早已被廣泛應(yīng)用。多重PCR是在單重PCR基礎(chǔ)上，在同一反應(yīng)體系中，同時加入多對特異性引物，擴增多個目的基因的技術(shù)手段[21-23]。在實際檢測工作中，當(dāng)樣品量非常大時，與單重PCR相比，多重PCR高效、簡便等特點則具有明顯優(yōu)勢。但多重PCR對擴增條件、引物序列、擴增產(chǎn)物大小等要求較高[24]，需要對反應(yīng)條件、引物濃度等進(jìn)行優(yōu)化，以提高反應(yīng)的擴增效率。

本研究選擇擴增CEV P4a基因548 bp、擴增KHV TK基因409bp及擴增KHV Sph基因292bp的3對特異性引物，通過優(yōu)化退火溫度和引物濃度，初步建立了鯉浮腫病毒和錦鯉皰疹病毒三重PCR檢測方法。敏感性試驗結(jié)果顯示，KHV敏感性有所下降，推測引物間的相互競爭可能是導(dǎo)致三重PCR敏感性有所下降重要原因。與實驗室普通單重PCR檢測方法相比，該方法大大縮短了檢測時間，提高了檢測效率，實現(xiàn)了一管多檢；擴增產(chǎn)物可直接測序，可進(jìn)行序列相似性和同源性分析；有較高的敏感性，檢測限為300 copies/μL；有良好的特異性，引物間不發(fā)生交叉反應(yīng)，以其他魚類DNA病毒作為模板進(jìn)行擴增，沒有目的條帶。

臨床樣品檢測結(jié)果表明，采用本研究建立的三重PCR方法檢測KHV，結(jié)果與實驗室常規(guī)方法檢測結(jié)果一致。檢測CEV時，只有4份樣品擴增出目的條帶，參考日本學(xué)者Oyamatsu等建立的nest-PCR方法對其余樣品的擴增產(chǎn)物進(jìn)行套式擴增，有9份樣品可獲得180 bp目的條帶，證明有13份CEV陽性樣品，與實驗室采用熒光定量PCR檢測方法結(jié)果一致。分析原因，擴增548 bp的引物序列在對病毒含量很低的樣品進(jìn)行擴增時只產(chǎn)生了微量的PCR產(chǎn)物，或易產(chǎn)生錯誤片段，需進(jìn)一步進(jìn)行套式擴增。

綜上所述，本研究通過對CEV和KHV三重PCR檢測方法的初步建立，明確了反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，適用于檢測病毒含量較高或發(fā)病狀況下的錦鯉樣品，針對病毒含量較低的樣品，彌補套式PCR的缺陷。與熒光PCR相比，擴增產(chǎn)物可直接測序進(jìn)行序列分析。該方法在引物序列方面還需改進(jìn)，需要在以后的工作中積累大量的陽性樣品以及序列信息，力求找到更加保守的序列和更通用的引物。本研究的建立為CEV和KHV檢測方法的研究提供了重要依據(jù)，為更好地檢測這2種常見魚類疫病奠定了一定的基礎(chǔ)。