黃平，竇長(zhǎng)武，鞠海濤，王宏偉，肖瑞，牛麗麗

0 引言

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，原發(fā)于神經(jīng)上皮細(xì)胞，約占顱內(nèi)腫瘤的40%～50%[1]，腦膠質(zhì)瘤具有廣泛的侵襲性，其惡性程度高，發(fā)病機(jī)制尚不清楚，手術(shù)難以徹底切除，且生長(zhǎng)速度快，術(shù)后易復(fù)發(fā)，預(yù)后差。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducers and activators of transcription, STAT）是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子蛋白，激活后可以轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)與特異性DNA結(jié)合[2]，從多個(gè)方面調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、分化和凋亡。STAT1是該家族的重要成員之一，在腫瘤形成過(guò)程中包括細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞凋亡、腫瘤血管生成以及腫瘤免疫監(jiān)視中發(fā)揮重要的作用，但該基因與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，以及如何調(diào)控并作用于神經(jīng)上皮組織，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)系統(tǒng)的報(bào)道。本研究探討STAT1與相關(guān)蛋白P53、P21、bcl-2、Caspase-8的相關(guān)性和變化趨勢(shì)，進(jìn)一步探討STAT1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251細(xì)胞周期的影響及可能的機(jī)制，為膠質(zhì)瘤治療的新策略提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，在含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2 主要試劑與儀器

pcDNA3.1-STAT1質(zhì)粒（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科鞠海濤博士惠贈(zèng)），DMEM/F-12(1:1)細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、0.25% 胰酶（美國(guó)Gibco公司），LipofectamineTM2000（美國(guó)Invitrogen公司），SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），STAT1 p84/p91多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），P53、P21抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），bcl-2、Caspase-8抗體（Abcam公司），人抗鼠IgG（H+L）（美國(guó)LI-COR公司）；熒光顯微鏡（中國(guó)Nikon公司），Western blot紅外熒光掃描系統(tǒng)（奧德賽CLX），Thermo酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

按LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明，制備LipofectamineTM2000復(fù)合物：每孔240 μl無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)基+10 μl LipofectamineTM2000（總體積250 μl），室溫孵育5 min；DNA復(fù)合物：每孔246 μl 無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)基+4 μg質(zhì)粒（質(zhì)粒濃度為1.0 μg/μl），總體積250 μl；將兩個(gè)復(fù)合物混合制成DNA-LipofectamineTM2000復(fù)合物，室溫靜置20 min；將6孔板中的細(xì)胞用無(wú)血清無(wú)雙抗的培養(yǎng)基清洗細(xì)胞2次，加入2 ml無(wú)血清培養(yǎng)基；將復(fù)合物逐滴加入孔中，輕輕搖動(dòng)6孔板，使其混勻，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中保溫6 h后，更換含血清無(wú)雙抗的培養(yǎng)基，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后進(jìn)行下一步檢測(cè)。將細(xì)胞分為Mock組（無(wú)轉(zhuǎn)染）、空載組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1）和STAT1組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT1）。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

轉(zhuǎn)染前一天，細(xì)胞換液，胰酶消化，計(jì)數(shù)，以1×105個(gè)/孔接種于96孔板中，每孔加入含血清無(wú)雙抗的DMEM 200 μl，設(shè)置調(diào)零組和對(duì)照組，每組10個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；每孔加入1 μg/μl質(zhì)粒0.2 μl，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑0.5 μl；分別在轉(zhuǎn)染24、48 h后向每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)；4 h后終止培養(yǎng)，去除培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μl，低速振蕩10 min，充分溶解MTT試劑；酶聯(lián)免疫儀上選擇490 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值，并計(jì)算10個(gè)復(fù)孔的平均值。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，倒去培養(yǎng)液，0.25%胰酶消化細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液輕輕吹打，1 000 r/min，離心5 min去上清液；加入4 ml PBS重懸細(xì)胞，吹打均勻后，再次1 000 r/min，離心5 min去上清液；加入1.2 ml PBS重懸細(xì)胞后，再加入2.8 ml 70%（預(yù)冷）乙醇中，輕輕吹打均勻，封口膜封口。4℃固定過(guò)夜（可長(zhǎng)至2周）。1 000 r/min，5 min收集固定細(xì)胞，加入4 ml PBS重懸細(xì)胞，輕輕吹打均勻后，再次1 000 r/min，離心5 min去上清液；用0.4 ml PBS重懸細(xì)胞，輕輕吹打（防止細(xì)胞破碎）；加RNase-A約3 μl至終濃度約為50 μg/ml，37℃水浴消化30 min；加PI約50 μl（此時(shí)終濃度為65 μg/ml），避光染色30 min。尼龍網(wǎng)過(guò)濾，上機(jī)檢測(cè)。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移

在6孔板背后劃?rùn)M線做標(biāo)記，線與線間隔約1 cm，在每孔中加入約5×105個(gè)細(xì)胞；細(xì)胞貼壁后，槍頭劃痕，PBS清洗細(xì)胞3次，加入無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)基；然后進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染4～6 h后更換無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)基，并放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在0和24 h后取出拍照。

1.7 Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組U251細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白P53、P21的表達(dá)情況

按照蛋白提取試劑盒說(shuō)明，提取轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞的總蛋白，利用BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后，100℃煮沸制備蛋白樣品。配置10%的分離膠，5%濃縮膠，膠凝固后進(jìn)行上樣，上樣時(shí)應(yīng)保證每孔蛋白量一致，濃縮膠電泳時(shí)間30～40 min，電壓為90 V，分離膠電泳時(shí)間為60～90 min，電壓為160 V，電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)玻璃板下緣時(shí)終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將膜放入平皿中（蛋白面朝上），倒入之前配好的封閉液，室溫下脫色，搖床上搖動(dòng)封閉1 h，加入一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜2次，10分鐘/次，加入熒光二抗常溫孵育1 h，TBST清洗PVDF膜3次，每次5 min。將PVDF膜進(jìn)行掃描，拍照并記錄。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以（±s）表示，對(duì)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1-STAT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞

倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)，Mock組轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好、形態(tài)均勻、細(xì)胞增殖旺盛且折光性好；與Mock組相比，空載組有少量細(xì)胞碎片及死細(xì)胞漂浮，但細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)無(wú)明顯差異；與Mock及空載組相比，STAT1組培養(yǎng)液中可見(jiàn)較多死細(xì)胞漂浮及細(xì)胞碎片，貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且生長(zhǎng)緩慢，形態(tài)不規(guī)則，伸長(zhǎng)或皺縮，折光性較差，見(jiàn)圖1。熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，STAT1組可見(jiàn)較多綠色熒光蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖2。

2.2 Western blot檢測(cè)pcDNA3.1-STAT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后STAT1蛋白表達(dá)情況

空載和pcDNA3.1-STAT1分別轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞48 h后，Western blot法檢測(cè)各組STAT1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與Mock組、空載組相比較，STAT1組的STAT1蛋白表達(dá)量明顯增高（1.26±0.25），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.043），而Mock組和空載組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1、圖3。

2.3 MTT比色法檢測(cè)pcDNA3.1-STAT1轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后細(xì)胞增殖活性

將轉(zhuǎn)染的腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用MTT法檢測(cè)各組的細(xì)胞增殖活性，以檢測(cè)高表達(dá)的STAT1對(duì)U251細(xì)胞增殖活性的影響。結(jié)果顯示，三組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），見(jiàn)表2。說(shuō)明轉(zhuǎn)染STAT1后明顯的抑制腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖。

表1 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT1后膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞STAT1蛋白的表達(dá)Table1 Expression of STAT1 protein in glioma U251 cells after transfection with pcDNA3.1-STAT1

表2 各組各時(shí)間點(diǎn)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖活性測(cè)定 (±s)Table2 Proliferation activity of glioma U251 cells at different time points in each group (±s)

表2 各組各時(shí)間點(diǎn)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖活性測(cè)定 (±s)Table2 Proliferation activity of glioma U251 cells at different time points in each group (±s)

Notes: *: P＜0.05, compared with Mock group; #: P＜0.05, compared with Mock group and Empty vector group, respectively

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2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT1后對(duì)U251細(xì)胞周期的影響

PI染色檢測(cè)STAT1轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞48 h后時(shí)的細(xì)胞周期情況，結(jié)果顯示：與Mock及空載組相比，STAT1組G0/G1期細(xì)胞比例明顯升高，S期比例明顯下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.006;P=0.033）。結(jié)果顯示，STAT1可抑制腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的DNA合成及有絲分裂，導(dǎo)致細(xì)胞阻滯在G0/G1期，見(jiàn)表3、圖4。

2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT1后對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞遷移能力的影響

圖1 轉(zhuǎn)染48 h后倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況 (×200)Figure1 Growth of glioma U251 cells observed under inverted phase contrast microscope 48 h after transfection (×200)

圖2 轉(zhuǎn)染48 h后熒光顯微鏡觀察pcDNA3.1-STAT1轉(zhuǎn)染情況 (×200)Figure2 Glioma U251 cells observed under fluorescence microscopy 48h after transfection with pcDNA3.1-STAT1 (×200)

表3 轉(zhuǎn)染48h后STAT1對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞周期的影響Table3 Effect of STAT1 on cell cycle of glioma U251 cells 48h after transfection

結(jié)果顯示，24 h后Mock組細(xì)胞就已經(jīng)遷移越過(guò)劃痕范圍，空載組遷移能力較Mock組細(xì)胞略差，而STAT1組進(jìn)入空白處的細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞遷移能力受到抑制，見(jiàn)表4、圖5。結(jié)果表明STAT1的高表達(dá)抑制了腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力（P=0.001）。

2.6 Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT1后各組U251細(xì)胞中P53、P21、bcl-2、Caspase-8的表達(dá)情況

空載質(zhì)粒和pcDNA3.1-STAT1分別轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞48 h后，Western blot檢測(cè)各組蛋白表達(dá)。STAT1組與Mock和空載組相比，P53、P21、Caspase-8表達(dá)明顯增強(qiáng)，bcl-2表達(dá)明顯減弱，STAT1組與Mock組和空載組相比均有顯著差異（均P＜0.05）；而上述蛋白表達(dá)在空載組和Mock組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表5、圖6～7。

圖3 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT1 48h后STAT1在U251細(xì)胞中的表達(dá)Figure3 Expression of STAT1 in U251 cells 48h after transfection with pcDNA3.1-STAT1

表4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT1 24h后對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞遷移能力的影響Table4 Migration ability of U251 cells after transfection with pcDNA3.1-STAT1 for 24h detected by wound healing assay

圖4 轉(zhuǎn)染48h后STAT1對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞周期的影響Figure4 Effect of STAT1 on cell cycle of glioma U251 cells 48h after transfection

3 討論

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最具有破壞性與侵略性的腫瘤[3]，約占膠質(zhì)瘤的50%左右[4]。近年來(lái)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病率呈年輕化趨勢(shì)，以青壯年為主要發(fā)病人群[5]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，腦膠質(zhì)瘤患者手術(shù)后中位生存時(shí)間平均約12～18月，5年生存率＜10%[6]。近年來(lái)，隨著分子診斷概念的引入和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的推廣[7]，膠質(zhì)瘤患者術(shù)后的生存率較前有所提高，但平均生存期仍然低于15月。隨著相關(guān)調(diào)控基因的發(fā)現(xiàn)與認(rèn)識(shí)，基因治療開(kāi)始進(jìn)入包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的各種惡性腫瘤的研究領(lǐng)域，并且被認(rèn)為是目前除手術(shù)、放療和化療以外的“第四模式”。

STAT是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子蛋白，是細(xì)胞因子/生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中重要的胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，激活后可以轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)與特異性的DNA結(jié)合，從多個(gè)方面調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、分化和凋亡。STAT1是該家族的重要成員之一，它不僅可被細(xì)胞因子激活，也可被生長(zhǎng)因子激活，比如表皮生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）[8]。目前已知STAT1在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，如白血病[9]、乳腺癌[10]、肝癌[11]等。STAT1在腫瘤形成過(guò)程中包括細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞凋亡、腫瘤血管生成以及腫瘤免疫監(jiān)視中發(fā)揮重要的作用，并且已有相關(guān)研究證實(shí)STAT1基因在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、轉(zhuǎn)移、侵襲等方面發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[12]，同時(shí)國(guó)內(nèi)學(xué)者已證實(shí)STAT1在腦膠質(zhì)瘤缺氧時(shí)起腫瘤抑制作用[13]。但該基因與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，以及如何調(diào)控并作用于神經(jīng)上皮組織，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)系統(tǒng)的報(bào)道。

圖5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT1后對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞遷移能力的影響Figure5 Migration ability of U251 cells after transfection with pcDNA3.1-STAT1 detected by wound healing assay

表5 P53、P21、bcl-2、Caspase-8在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT1腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中的表達(dá) (±s)Table5 Expression of P53, P21, bcl-2 and Caspase-8 in U251 cells after transfection with pcDNA3.1-STAT1 (±s)

表5 P53、P21、bcl-2、Caspase-8在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT1腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中的表達(dá) (±s)Table5 Expression of P53, P21, bcl-2 and Caspase-8 in U251 cells after transfection with pcDNA3.1-STAT1 (±s)

Note: *: P＜0.05, compared with Mock and Empty vector group,respectively

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圖6 P53、P21在轉(zhuǎn)染STAT1腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中的表達(dá)Figure6 Expression of P53 and P21 in U251 cells after transfection with STAT1

圖7 bcl-2、Caspase-8在轉(zhuǎn)染STAT1腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中的表達(dá)Figure7 Expression of bcl-2 and caspase-8 in U251 cells after transfection with STAT1

在前期實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)，STAT1在膠質(zhì)瘤組織中低表達(dá)，而在正常腦組織中高表達(dá)[14-15]。本研究中，Western blot結(jié)果顯示在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系中STAT1蛋白為高表達(dá)；MTT結(jié)果顯示，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT1質(zhì)粒后，STAT1組U251細(xì)胞增殖明顯受到抑制。由此可知，LipofectamineTM2000成功將pcDNA3.1-STAT1導(dǎo)入U(xiǎn)251細(xì)胞中，并且轉(zhuǎn)染后高表達(dá)的STAT1可抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外，細(xì)胞周期阻滯是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡重要的原因。本研究流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示，與Mock組和空載組相比，腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系中高表達(dá)的STAT1可顯著抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生；因此，高表達(dá)的STAT1能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生G0/G1期阻滯，從而減弱膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外的增殖能力；劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在STAT1轉(zhuǎn)染24 h后，STAT1組遷移能力急劇下降。這一結(jié)果提示STAT1的高表達(dá)可直接抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力。

P53是一種抑癌基因，在惡性腫瘤中，有超過(guò)50%的該基因發(fā)生突變。由這種基因編碼的蛋白質(zhì)是一種轉(zhuǎn)錄因子，它控制著細(xì)胞周期的啟動(dòng)，當(dāng)細(xì)胞缺乏P53基因時(shí)，即使在不利條件下，細(xì)胞仍可以繼續(xù)進(jìn)行分裂。與所有其他的腫瘤抑制基因相同，P53基因可減慢正常細(xì)胞的分裂[16]。P21是CIP家族的成員，是位于P53基因下游的細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子，它可以通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期的作用，抑制某些細(xì)胞的有絲分裂活動(dòng)，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。P21可以和P53共同構(gòu)成細(xì)胞周期G1/S檢查站，參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)[17]。有學(xué)者以siRNA-STAT1和pcDNA3.1-STAT1轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞，通過(guò)Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中P53、Cyclin E的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)STAT1可以上調(diào)P53的表達(dá)，抑制Cyclin E的表達(dá)，從而導(dǎo)致了細(xì)胞周期阻滯、生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞凋亡[18]。

細(xì)胞周期阻滯涉及復(fù)雜的分子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，各種基因的功能障礙可能導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯的發(fā)生和發(fā)展。研究表明，STAT1抗腫瘤效應(yīng)是通過(guò)上調(diào)P53實(shí)現(xiàn)的[19]，而P53的上調(diào)又可以促進(jìn)P21的表達(dá)[20]，使細(xì)胞周期阻滯于G1/S期，而細(xì)胞凋亡常發(fā)生于細(xì)胞周期的G1期，從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[21]。正常情況下細(xì)胞分裂周期進(jìn)程的轉(zhuǎn)化由Cyclin-CDK（Cyclin-dependent kinase）復(fù)合物對(duì)細(xì)胞精確而嚴(yán)密的調(diào)控，例如CyclinE-CDK2、CyclinA-CDK2及其抑制劑（CKI）P21Cip1、P27Kip1的活性來(lái)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)程。研究表明，P53可誘導(dǎo)P21Waf1調(diào)控Cyclin E/CDK2和Cyclin A/CDK2復(fù)合物使RB磷酸化，P53和RB通路共同調(diào)控細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換，而腫瘤細(xì)胞中這兩條通路往往同時(shí)失調(diào)[22]。

B細(xì)胞淋巴瘤-2（bcl-2）家族蛋白被認(rèn)為是程序性細(xì)胞死亡和凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在人類癌癥中具有突出作用[23]。根據(jù)其功能可分為兩類蛋白亞群[24]：一類為凋亡抑制蛋白（bcl-2、bcl-xL、bcl-xY等），是抗癌治療的主要靶點(diǎn)；另一類為凋亡促進(jìn)蛋白（bax、bix、bad等）。所有bcl-2家族蛋白都具有共同的bcl-2同源（BH）結(jié)構(gòu)域。bcl-2蛋白能調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中適宜的Ca2+濃度，使其保持動(dòng)態(tài)平衡，避免線粒體中由于Ca2+濃度過(guò)高而引起細(xì)胞凋亡。此外，bcl-2還依靠抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C來(lái)抑制細(xì)胞的凋亡，同時(shí)還可以抑制Smac/DIABLO的釋放[25]。Caspase-8是死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑中關(guān)鍵的啟動(dòng)因子，細(xì)胞凋亡依賴一類對(duì)天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶（Caspase）產(chǎn)生的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Caspase-8能夠通過(guò)寡聚而自身切割活化，并能激活下游半胱氨酸蛋白酶，產(chǎn)生凋亡效應(yīng)[26]。

本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)Western blot檢測(cè)了P53、P21、bcl-2、Caspase-8的表達(dá)情況，結(jié)果表明，STAT1組的P53、P21、Caspase-8表達(dá)明顯增加，bcl-2表達(dá)明顯降低，其機(jī)制可能為STAT1可上調(diào)P53、P21、Caspase-8，下調(diào)bcl-2，使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，而細(xì)胞凋亡常發(fā)生于細(xì)胞周期的G1期，從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。這說(shuō)明STAT1調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡作用是經(jīng)多分子信號(hào)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這可能是腦膠質(zhì)瘤發(fā)生的機(jī)制之一，但此推測(cè)還需要大量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證和研究。