郝曉慧,趙明中，張玉芝，張祖峰，朱秋平，牛方卿

1)鄭州市第九人民醫(yī)院心臟中心 鄭州 450053 2)阜外華中心血管病醫(yī)院心內(nèi)科 鄭州 450000

動脈粥樣硬化是一種嚴(yán)重的心血管系統(tǒng)疾病，其與2型糖尿病、冠心病等的發(fā)生關(guān)系密切。氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，OxLDL)是一種促動脈粥樣硬化發(fā)生因子，在動脈粥樣硬化發(fā)生時表達(dá)升高，具有損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用[1-2]。E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated gene,CREG)是一種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，具有抑制細(xì)胞增殖和生長的作用，其在分化細(xì)胞中表達(dá)水平較高，而在去分化的胚胎干細(xì)胞、胚胎瘤細(xì)胞等細(xì)胞中低表達(dá)[3]。有研究[4-6]顯示，CREG參與動脈粥樣硬化的發(fā)生，在動脈粥樣硬化患者、動物模型動脈粥樣硬化組織中均表達(dá)下調(diào)；CREG還可以減輕ApoE-小鼠動脈粥樣硬化程度和抑制VP-16誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。CREG在OxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用目前尚不明確。本實驗觀察了過表達(dá)CREG對OxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響，為研究動脈粥樣硬化血管損傷的發(fā)生機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1材料血管內(nèi)皮細(xì)胞購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。pLNCX-CREG重組逆轉(zhuǎn)錄病毒和對照逆轉(zhuǎn)錄病毒由湖南豐暉生物科技有限公司構(gòu)建。OxLDL購自北京索萊寶科技有限公司，蛋白裂解液購自碧云天生物技術(shù)研究所，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，CREG抗體購自美國Santa Cruz公司，Trizol法RNA提取試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自德國Qiagen公司，Real-time PCR試劑盒購自上海索寶生物科技有限公司，活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平檢測試劑盒購自上海研拓生物科技有限公司，丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量檢測試劑盒購自北京吉美生物技術(shù)有限公司，超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,SOD)活性檢測試劑盒購自深圳子科生物科技有限公司，活化的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)抗體購自美國CTS公司。

1.2細(xì)胞分組取血管內(nèi)皮細(xì)胞接種到24孔板，接種密度為1×106個/L。分為4組，空白對照組不處理；OxLDL組用含100 mg/L OxLDL的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h；另2組分別感染對照逆轉(zhuǎn)錄病毒(陰性對照組)和pLNCX-CREG重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(pLNCX-CREG組)，用800 mg/L的G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的血管內(nèi)皮細(xì)胞，之后均用含100 mg/L OxLDL的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

1.3細(xì)胞中CREGmRNA表達(dá)的檢測采用Real-time PCR。利用Trizol法RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，-80 ℃保存。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，步驟參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列：CREG上游5’-TACTGAGTCCGCTGCAACAAG-3’，下游5’-ATGAGCCTTGGAAGACCTGTCG-3’；β-actin上游5’-AAGGATTCCTATGTGGGC-3’，下游5’-CATCTCAAGCTCGAAGTC-3’。反應(yīng)體系：2 μL的cDNA，上、下游引物各0.4 μL，10 μL的SYBR Advantage Premix，0.4 μL的ROX Dye，6.8 μL ddH2O。反應(yīng)程序：94 ℃反應(yīng)5 min；94 ℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃10 min，40個循環(huán)。依照2-ΔΔCt方法計算CREG表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次，下同。

1.4細(xì)胞中CREG蛋白表達(dá)的檢測采用Western blot法。取上述各組細(xì)胞，添加PMSF/RIPA蛋白裂解液，吹打混合裂解，4 ℃高速離心。吸取上清，用常規(guī)BCA法定量檢測，保存于-80 ℃。蛋白樣品上樣量20 μg，電泳后常規(guī)方法濕轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)膜后的NC膜置于封閉液(10 mL的TBST溶解300 mg脫脂奶粉)中37 ℃反應(yīng)1.5 h。加入用封閉液按1∶4 000稀釋的CREG一抗，4 ℃條件下過夜反應(yīng)。加入同法配制按1∶4 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗，室溫結(jié)合1.5 h，ECL顯色試劑盒顯色，采集圖像并分析CREG和內(nèi)參β-actin條帶的灰度值，二者的比值即為CREG蛋白的表達(dá)水平。

1.5細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量、SOD活性及ROS水平檢測取4組細(xì)胞，檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量和SOD活性，同時檢測ROS水平，步驟均參照試劑盒說明書。MDA檢測用硫代巴比妥酸法，SOD檢測用黃嘌呤氧化酶法，ROS檢測用DCFH-DA法。

1.6細(xì)胞凋亡檢測采用流式細(xì)胞術(shù)。取4組細(xì)胞，以2.5 g/L的胰蛋白酶消化，每組收集1×106個細(xì)胞，用PBS洗滌3次，添加500 μL的Binding Buffer后，再依次添加Annexin V-FITC 5 μL和PI 5 μL，混合后孵育15 min。上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.7細(xì)胞中CleavedCaspase-3蛋白表達(dá)水平的檢測取4組細(xì)胞，用Western blot法檢測Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)水平，Cleaved Caspase-3抗體按1∶600稀釋，余步驟同1.4。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較4組間以上指標(biāo)的差異，兩兩比較用SNK-q檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組細(xì)胞中CREG表達(dá)的比較見圖1、表1。與空白對照組比較，OxLDL組和陰性對照組細(xì)胞中CREG mRNA和蛋白的表達(dá)水平均降低，而pLNCX-CREG組CREG mRNA和蛋白表達(dá)水平均較OxLDL組和陰性對照組升高。

1～4:分別為空白對照組、OxLDL組、陰性對照組、pLNCX-CREG組

圖1 4組細(xì)胞中CREG蛋白的表達(dá)

*:與空白對照組比較，P<0.05；#:與OxLDL組及陰性對照組比較，P<0.05

2.2 4組細(xì)胞培養(yǎng)液中氧化損傷因子水平比較見表2。與空白對照組比較，OxLDL組和陰性對照組SOD活性降低，MDA和ROS水平升高；與OxLDL組及陰性對照組比較，pLNCX-CREG組細(xì)胞中SOD活性升高，MDA和ROS水平降低。

表2 4組細(xì)胞培養(yǎng)液中氧化損傷因子水平比較(n=3)

*:與空白對照組比較，P<0.05；#:與OxLDL組及陰性對照組比較，P<0.05

2.3 4組細(xì)胞凋亡率及CleavedCaspase-3蛋白表達(dá)水平比較見圖2、表3。與空白對照組比較，OxLDL組和陰性對照組細(xì)胞凋亡率和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平均升高；與OxLDL組及陰性對照組比較，pLNCX-CREG組細(xì)胞凋亡率和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平均降低。

1～4：分別為空白對照組、OxLDL組、陰性對照組及pLNCX-CREG組

圖2 4組細(xì)胞中Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較

*:與空白對照組比較，P<0.05；#:與OxLDL組及陰性對照組比較，P<0.05

3 討論

動脈粥樣硬化是多數(shù)心腦血管疾病發(fā)生的基礎(chǔ)，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動脈粥樣硬化發(fā)生的機(jī)制之一。動脈粥樣硬化發(fā)生時，OxLDL等刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞致細(xì)胞發(fā)生過度凋亡和氧化損傷，完整的血管組織受到破壞，最終影響血管正常功能發(fā)揮[7-9]。動脈粥樣硬化的危險因素主要有高血壓、糖尿病、肥胖、OxLDL等，其中OxLDL是動脈粥樣硬化發(fā)生的必要條件[10-13]。本實驗結(jié)果表明，OxLDL處理后血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中ROS水平也升高，說明OxLDL能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，提示成功構(gòu)建了動脈粥樣硬化血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型。

CREG蛋白含有220個氨基酸，具有3個磷酸化位點，可以通過與不同的配體結(jié)合發(fā)揮多種生物學(xué)功能[14]。研究[15-16]表明，CREG一方面能夠與腺病毒的E1A結(jié)合，從而激活下游靶基因，促進(jìn)細(xì)胞增殖；另一方面還能夠與E1A競爭性結(jié)合靶基因，從而抑制E1A對靶基因的激活，發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用；CREG同樣可以結(jié)合哺乳動物體內(nèi)的E2F或競爭性地結(jié)合靶基因從而發(fā)揮增殖促進(jìn)或抑制作用。近年來的研究[17-18]表明，CREG在動脈粥樣硬化血管中表達(dá)下調(diào)，并且能夠降低血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡水平，此外，CREG還具有減輕小鼠動脈粥樣硬化的作用。以上研究均表明，CREG可能在動脈粥樣硬化血管損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。本實驗結(jié)果顯示，OxLDL處理后的血管內(nèi)皮細(xì)胞CREG表達(dá)下調(diào)，而感染CREG重組病毒后過表達(dá)CREG能夠減輕OxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，這提示過表達(dá)CREG能夠抑制OxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。氧化應(yīng)激是動脈粥樣硬化血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要機(jī)制之一，OxLDL能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞中抗氧化酶SOD活性下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS不能被及時清除。ROS可以激活細(xì)胞中Caspase凋亡反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生；另外，ROS還能夠引起細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量的MDA。因此，細(xì)胞中MDA含量、SOD活性及ROS水平可以間接反映細(xì)胞氧化損傷程度[19-21]。研究[22]顯示，CREG具有抗氧化應(yīng)激的作用，其可以減少鹽敏感大鼠冠狀動脈中MDA含量。本實驗結(jié)果表明，CREG過表達(dá)可以減少OxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中ROS和MDA含量，提高SOD活性，減少細(xì)胞中活化的Caspase-3蛋白表達(dá)，提示過表達(dá)CREG具有抗OxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的作用。

總之，CREG可降低OxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷并抑制細(xì)胞凋亡，但目前對CREG靶向調(diào)控動脈粥樣硬化血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷和凋亡的機(jī)制尚不明確；本實驗結(jié)果為研究動脈粥樣硬化血管損傷提供了參考，為明確CREG在心血管系統(tǒng)疾病中的作用奠定了基礎(chǔ)。