司 文,郭 壯,周 華

1)勝利油田中心醫(yī)院內(nèi)分泌科 山東東營(yíng) 257034 2)勝利油田中心醫(yī)院消化內(nèi)科 山東東營(yíng) 257034 3)山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院血管外科 濟(jì)南250021

高糖誘導(dǎo)的心血管系統(tǒng)疾病是人類致殘、致死的重要原因[1]；高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是糖尿病心腦血管疾病發(fā)生的基礎(chǔ)[1-2]。黃芪多糖由中藥黃芩中提取，具有提高機(jī)體免疫力、抑制衰老等藥理學(xué)作用，在心血管系統(tǒng)疾病中發(fā)揮保護(hù)作用；黃芪多糖可以減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，促進(jìn)血管內(nèi)皮功能恢復(fù)[3-4]。Smac是一種強(qiáng)促凋亡因子，在細(xì)胞的凋亡、分化等過程中扮演重要角色，并參與糖尿病、腫瘤等疾病的發(fā)生[5-6]。本研究探討黃芪多糖聯(lián)合Smac shRNA對(duì)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，為減輕糖尿病血管內(nèi)皮組織損傷提供參考。

1 材料與方法

1.1材料人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株EVC-304購(gòu)自上海繼和生物科技有限公司。Smac shRNA慢病毒和對(duì)照慢病毒由吉滿生物科技(上海)有限公司構(gòu)建。Real-time PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，黃芪多糖購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所，激活型Caspase-3(C-Caspase-3)、C-Caspase-9抗體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，過氧化氫酶(catalase, CAT)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司，Smac抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2慢病毒感染和干擾效果檢測(cè)EVC-304細(xì)胞接種于24孔板，密度達(dá)40%時(shí)分別用Smac shRNA慢病毒和對(duì)照慢病毒感染，然后用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定感染細(xì)胞，分別用Real-time PCR和Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中Smac mRNA和蛋白表達(dá)水平。

Real-time PCR：細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后，提取總RNA，以紫外分光光度計(jì)法測(cè)定濃度、純度，-70 ℃保存。取RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以Real-time PCR檢測(cè)Smac mRNA水平。引物序列：Smac上游5’-GCAAGCTTCCACCATGGCGGCTCTGAAGAG-3’，下游5’-CAGGGATCCTCAATCCTCACGCAGGTAG GCCTC-3’。內(nèi)參GAPDH上游5’-GAAGGTGAAG GTCGGAGTC-3’，下游5’-GAAGATGGTGATGG GATTTC-3’。 反應(yīng)體系：0.5 μmol/L的上下游引物各1 μL、12.5 μL的SYBR Premix TaqTM、1 μL的cDNA模板、添加ddH2O補(bǔ)足至40 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min(預(yù)變性)；95 ℃ 30 s(變性)，55 ℃ 30 s(退火)，72 ℃ 1 min(延伸)，循環(huán)35次。用2-ΔΔCt法計(jì)算Smac mRNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，下同。

Western blot：細(xì)胞中添加三去污裂解液，置于冰上裂解30 min。將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，4 ℃，12 000 ×g離心10 min。吸取上清，置于-80 ℃中保存。收集2 μL的蛋白，以BCA法定量。將1體積的蛋白樣品與4倍體積的5×上樣緩沖液在100 ℃煮沸10 min。配制蛋白凝膠(100 g/L的分離膠、50 g/L的濃縮膠)。每個(gè)泳道上樣20 μg蛋白，電泳后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，于體積分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白中，37 ℃搖床孵育2 h。加入按1∶800稀釋的Smac抗體， 4 ℃孵育過夜，用TBST洗滌3次，加入1∶5 000稀釋HRP標(biāo)記的IgG，37 ℃孵育2 h。用ECL試劑發(fā)光以后，收集圖像，以GAPDH為內(nèi)參，分析Smac蛋白表達(dá)水平。

1.3細(xì)胞分組處理將EVC-304細(xì)胞分為4組，對(duì)照組未處理，黃芪多糖組給予300 mg/L黃芪多糖，干擾組感染Smac shRNA慢病毒，黃芪多糖+干擾組用300 mg/L黃芪多糖培養(yǎng)感染Smac shRNA慢病毒的EVC-304細(xì)胞，3 d后4組均用30 mmoL/L的葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集各組細(xì)胞，離心，細(xì)胞沉淀中添加Binding Buffer 500 μL，混勻，再添加5 μL的Annexin V-FITC、5 μL的PI，放在避光環(huán)境中15 min后，用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

1.5細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD、CAT活性和MDA含量檢測(cè)收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，分別用試劑盒檢測(cè)SOD、CAT活性和MDA含量，步驟均參照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程。

1.6細(xì)胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表達(dá)的檢測(cè)收集各組細(xì)胞，用Western blot檢測(cè)細(xì)胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表達(dá)水平(抗體稀釋度均為1∶400)，具體操作步驟同1.2。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較感染Smac shRNA慢病毒和對(duì)照慢病毒的EVC-304細(xì)胞中Smac mRNA和蛋白表達(dá)的差異，采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析探討黃芪多糖和Smac shRNA干擾對(duì)高糖培養(yǎng)的EVC-304細(xì)胞凋亡及相關(guān)因子表達(dá)的影響，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1SmacshRNA干擾效果感染Smac shRNA慢病毒的EVC-304細(xì)胞Smac mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于感染對(duì)照慢病毒的細(xì)胞。見圖1、表1。

1、2：分別為感染對(duì)照慢病毒及Smac shRNA慢病毒的細(xì)胞

組別Smac mRNASmac蛋白感染對(duì)照慢病毒組1.00±0.070.99±0.05感染Smac shRNA慢病毒組0.56±0.050.46±0.06t15.24211.754P<0.001<0.001

2.2 4組細(xì)胞凋亡率比較Smac shRNA干擾和黃芪多糖均可抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，二者聯(lián)用有協(xié)同作用。見表2。

2.3 4組細(xì)胞培養(yǎng)液中CAT、SOD活性及MDA含量比較Smac shRNA干擾或黃芪多糖處理均可提高細(xì)胞培養(yǎng)液上清SOD和CAT活性，降低MDA含量，且二者聯(lián)用有協(xié)同作用。見表2。

表2 4組細(xì)胞凋亡率及培養(yǎng)液中 CAT、SOD活性和MDA含量比較(n=3)

2.4 4組細(xì)胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表達(dá)的比較Smac shRNA干擾或黃芪多糖處理均可抑制高糖條件下EVC-304細(xì)胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白的表達(dá)，二者聯(lián)用有協(xié)同作用。見圖2、表3。

1～4：分別為對(duì)照組、干擾組、黃芪多糖和黃芪多糖+干擾組

圖2 4組細(xì)胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白的表達(dá)

3 討論

黃芪多糖具有多種藥理學(xué)作用如抗氧化、提高免疫力等[3-4]。研究[4,7-11]表明，黃芪多糖具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷的作用，其可以抑制缺氧復(fù)氧、腫瘤壞死因子-α等誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪多糖可以減少高糖環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，提示黃芪多糖具有抗糖尿病血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用。

Smac基因由7個(gè)外顯子組成，定位于12號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，Smac基因編碼的蛋白含有239個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為28 000，在其氨基末端含有一個(gè)由55個(gè)氨基酸組成的線粒體靶序列，在線粒體定位中發(fā)揮作用[12-13]。Smac是一個(gè)凋亡促進(jìn)因子，Smac蛋白能夠促進(jìn)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活，從而發(fā)揮促進(jìn)凋亡的作用[14]。Smac在人體多種組織中均有表達(dá)，參與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持、胚胎發(fā)育等過程；另外，Smac參與糖尿病血管損傷的發(fā)生，干擾Smac可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[15-16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干擾Smac表達(dá)可以抑制高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9蛋白的活化，這與Smac促凋亡作用相符合，說明Smac可能是防治糖尿病血管內(nèi)皮功能障礙的靶點(diǎn)之一。

糖尿病心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，高糖環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞中的氧化平衡狀態(tài)被打破，細(xì)胞過度凋亡，影響血管內(nèi)皮功能[17]。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)存在抗氧化酶系統(tǒng)，抗氧化酶活性與細(xì)胞內(nèi)氧自由基水平密切相關(guān)。細(xì)胞內(nèi)氧自由基可以使存在于細(xì)胞膜上的脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致膜損傷，使得存在于細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶等物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞外。SOD和CAT是兩個(gè)重要的氧自由基清除劑，其活性降低可直接導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧自由基過度積累，而過量的氧自由基可以激活細(xì)胞內(nèi)Caspase凋亡反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18-19]。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量的高低可以直接反映細(xì)胞氧化損傷程度[20]。本研究結(jié)果顯示，干擾Smac或黃芪多糖均可提高高糖環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞SOD和CAT活性，降低MDA水平，且二者聯(lián)合有協(xié)同作用，提示干擾Smac和黃芪多糖聯(lián)合可以提高血管內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化能力，減少氧化損傷。

綜上，黃芪多糖和Smac干擾均可抑制高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞抗氧化能力，減少氧化損傷，且二者聯(lián)合有協(xié)同作用，但其具體的調(diào)控機(jī)制和靶向作用位點(diǎn)尚不明確。干擾Smac聯(lián)合黃芪多糖可能是緩解糖尿病血管內(nèi)皮損傷的途徑之一。