肖中岳，軒青霞，高 強(qiáng)

1)河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 河南洛陽 471003 2)洛陽市婦女兒童醫(yī)療保健中心超聲科 河南洛陽 471023

炎癥性腸病是由多種因素引起的慢性復(fù)發(fā)性非特異性的炎癥疾病[1]。目前的研究[2-3]顯示，該病的發(fā)生是由于多種致病因素破壞了腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，使得腸道黏膜的免疫功能發(fā)生失調(diào)，進(jìn)而損傷腸道的黏膜屏障，最終導(dǎo)致炎癥性腸病的發(fā)生。不同類型的腸道黏膜上皮細(xì)胞的協(xié)同作用是腸道黏膜屏障形成的基礎(chǔ)，其中杯狀細(xì)胞是腸道上皮中的黏液分泌細(xì)胞，其分泌的黏液可以有效地保護(hù)腸道黏膜，減少腸道黏膜損傷[4-6]。近期研究[7]發(fā)現(xiàn)，杯狀細(xì)胞減少與人克羅恩病活動期和潰瘍性結(jié)腸炎有關(guān)。Cyp4a14蛋白是一種肝臟細(xì)胞色素P450 ω-羥化酶，在人體中其主要作用是參與中長鏈脂肪酸和前列腺素的氧化代謝[8]。有研究[9]顯示，Cyp4a14蛋白可以破壞體內(nèi)氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡，導(dǎo)致大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)和脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體的炎癥反應(yīng)。本研究通過建立Cyp4a14基因敲除小鼠腸炎模型，探討Cyp4a14基因在腸炎發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實驗動物 健康清潔級129S1/SvJ種系Cyp4a14野生型(wild type,WT；Cyp4a14+/+)和基因敲除純合型(knockout,KO；Cyp4a14-/-)小鼠(由深圳大學(xué)提供)，飼養(yǎng)于河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗中心，維持室內(nèi)溫度20～22 ℃，濕度保持在50%左右，室內(nèi)燈光明暗交替的周期是12 h，給予小鼠足量SPF級混合配方顆粒飼料(購于北京華阜康生物公司)，自由飲水，每日更換新鮮飲水，保持小鼠生活環(huán)境清潔衛(wèi)生及通風(fēng)良好。

1.1.2 主要試劑 葡聚糖硫酸鈉(DSS，相對分子質(zhì)量為36 000～50 000)購于美國MP Biomedicals公司。快速DNA提取擴(kuò)增試劑盒購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，PAS染色試劑盒購于美國Sigma公司?？俁NA提取試劑Trizol購于美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR試劑盒購于日本TaKaRa公司，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1)。

1.2入組準(zhǔn)備由于Cyp4a14基因的表達(dá)與性別有關(guān)[10]，實驗過程中所用小鼠均為雄性。選用WT和KO同窩小鼠作為種鼠，繁殖出的后代可出現(xiàn)WT(Cyp4a14+/+)、雜合子(Cyp4a14+/-)和KO(Cyp4a14-/-)3種表型。剪取小鼠尾巴末端約0.5 cm，按快速DNA提取擴(kuò)增試劑盒說明書操作抽提DNA，隨后PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定小鼠基因。引物序列：Cyp4a14+/+，5’-TCAGGGTT GAAAAAGAATGAC-3’；Cyp4a14-/-，5’-GCCAGAG GCCACTTGTGTAG-3’；Cyp4a14+/-，5’-TGC CCATTTTTCACACAAAA-3’。Cyp4a14+/+目的片段長299 bp，Cyp4a14-/-目的片段長199 bp，Cyp4a14+/-目的片段長299和199 bp，根據(jù)條帶判斷每只小鼠的基因型(圖1)。

表1 引物序列

M：Marker；1：Cyp4a14+/+; 2：Cyp4a14+/-; 3：Cyp4a14-/-

1.3小鼠分組與腸炎模型建造選擇6～8周齡、體重為18～25 g小鼠，通過基因鑒定分為WT組和KO組，各20只，再將WT組和KO組小鼠隨機(jī)分成WT對照組、WT DSS組和KO對照組、KO DSS組，每組10只。先將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，然后對照組給予高壓滅菌飲用水，DSS組給予含30 g/L DSS高壓滅菌飲用水，自由飲用6 d。各組小鼠給予足量飼料，不再另予飲水。每日定時測量小鼠體重，觀察并記錄小鼠的攝食飲水量、大便性狀以及活動情況等，參照J(rèn)ackson等[11]的方法進(jìn)行疾病活動指數(shù)(DAI)評分。

1.4取材及血便評分造模結(jié)束后處死所有小鼠，剖腹取出全結(jié)腸，測量結(jié)腸長度并肉眼觀察結(jié)腸內(nèi)容物情況。按照張靜等[12]的方法進(jìn)行血便評分：0分，無出血；1分，結(jié)腸1/3出血；2分，結(jié)腸2/3出血；3分，整個結(jié)腸內(nèi)均有出血。用預(yù)冷的PBS漂洗后，自遠(yuǎn)端結(jié)腸始取約0.5 cm，用甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚度切片，用于HE染色、PAS染色及免疫組化染色；再取1.0 cm放入RNA Later液中，-80 ℃保存，用于提取RNA。

1.5結(jié)腸組織病理學(xué)觀察及評分對結(jié)腸組織進(jìn)行HE染色后，400倍顯微鏡下行細(xì)胞計數(shù)，每張切片選擇10個視野，然后在每個視野中觀察100個細(xì)胞。參照文獻(xiàn)[13]的評分標(biāo)準(zhǔn)對切片進(jìn)行組織學(xué)評分。中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤：0～3分；潘氏細(xì)胞和杯狀細(xì)胞脫顆粒：0～2分；上皮細(xì)胞反應(yīng)，如隱窩缺失：0～3分；炎癥病灶：0～3分。各項評分相加得出組織病理學(xué)評分，急性炎癥的臨界值為6～7分。

1.6結(jié)腸和肝臟組織中Cyp4a14以及炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表達(dá)的檢測總RNA提取采用Trizol法，測定純度和濃度后取RNA 2 μg，使用TaKaRa試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-30 ℃凍存?zhèn)溆?。冰上制備PCR反應(yīng)體系，以β-actin作為內(nèi)參，以Ct值表示結(jié)果，每個樣本3個復(fù)孔，PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，59 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算各指標(biāo)mRNA的相對表達(dá)量。

1.7結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞計數(shù)采用PAS染色法對結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞進(jìn)行染色。在400倍顯微鏡下進(jìn)行杯狀細(xì)胞計數(shù)，每張切片在黏膜層選擇10個視野，計數(shù)每個視野中的杯狀細(xì)胞。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。對照組和DSS組間結(jié)腸長度、血便評分、組織病理學(xué)評分、杯狀細(xì)胞計數(shù)和3種炎癥因子、Cyp4a14 mRNA相對表達(dá)量的比較采用兩獨立樣本的t檢驗或校正t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1一般情況觀察及DAI評分KO對照組和WT對照組小鼠每天攝食飲水正常，反應(yīng)機(jī)警，皮毛光澤，體重均增加。KO DSS組小鼠于造模第4天開始出現(xiàn)攝食飲水減少、懶動、體重下降，并伴有稀便、肛周潮濕等現(xiàn)象；造模第6天可觀察到數(shù)只小鼠出現(xiàn)血便，但體重下降未超過12%。WT DSS組小鼠于造模第3天相繼出現(xiàn)攝食飲水減少、懶動、精神萎靡、體毛凌亂、稀水樣便、血便以及肛周潮濕等現(xiàn)象；造模第6天，全部小鼠均出現(xiàn)嚴(yán)重肉眼血便，體重下降接近25%，但無小鼠死亡。與2個對照組相比，KO DSS組和WT DSS組DAI評分均增高，且WT DSS組增高更明顯(圖2)。

圖2 各組小鼠體重變化(上)及DAI評分(下)比較

2.2結(jié)腸長度和血便評分WT對照組、WT DSS組結(jié)腸長度分別為(8.07±0.66)、(4.89±0.44) cm(t=11.000,P<0.001)。KO對照組、KO DSS組結(jié)腸長度分別為(7.52±0.61)、(5.22±0.47) cm(t=9.449,P<0.001)。WT DSS組、KO DSS組血便評分分別為(2.90±0.32)和(2.20±0.79)，WT對照組和KO對照組均無血便。

2.3結(jié)腸組織病理學(xué)觀察、評分及杯狀細(xì)胞計數(shù)KO對照組和WT對照組小鼠組織學(xué)觀察可見結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，無炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，KO對照組小鼠結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞數(shù)量較WT對照組明顯增加；KO DSS組結(jié)腸黏膜腺體基本完整，杯狀細(xì)胞大而不規(guī)則，胞漿內(nèi)有少量分泌顆粒填充，杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，局部在鏡下可以觀察到少量炎性細(xì)胞浸潤或者隱窩破壞，呈輕度炎癥改變；WT DSS組鏡下觀察到黏膜上皮細(xì)胞廣泛缺失，局部出現(xiàn)糜爛，腺體多數(shù)不完整，黏膜及黏膜下細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列紊亂，杯狀細(xì)胞幾乎消失，炎性細(xì)胞廣泛浸潤，呈嚴(yán)重炎癥改變(圖3)。各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評分及杯狀細(xì)胞計數(shù)的比較見表2、3。

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織HE染色(A～D)和PSA染色(E～H)結(jié)果(×400)

組別組織病理學(xué)評分杯狀細(xì)胞計數(shù)WT對照組0.61±0.2019.82±0.54WT DSS組10.70±0.482.10±1.20t61.16742.705P<0.001<0.001

表3 KO組小鼠組織病理學(xué) 評分和杯狀細(xì)胞計數(shù)比較(n=10)

2.4結(jié)腸和肝臟組織中IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)結(jié)果見表4～7。

表4 WT組結(jié)腸組織中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA相對表達(dá)量的比較(n=10)

表5 KO組結(jié)腸組織中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA相對表達(dá)量的比較(n=10)

表6 WT組肝臟組織中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA相對表達(dá)量的比較(n=10)

表7 KO組肝臟組織中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA相對表達(dá)量的比較(n=10)

2.5結(jié)腸和肝臟組織中Cyp4a14mRNA的表達(dá)無論是WT組還是KO組小鼠結(jié)腸組織中均檢測不到Cyp4a14 mRNA的表達(dá)；WT DSS組小鼠肝臟組織中Cyp4a14 mRNA的表達(dá)較WT對照組下降[(1.0±0.1)和(9.3±0.1)，t=8.852，P<0.001]。

3 討論

Cyp4a14蛋白的主要作用是參與脂肪酸代謝、調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化及氧化應(yīng)激，從而參與炎癥反應(yīng)[9，14]。Cyp4a14在機(jī)體炎癥反應(yīng)過程中存在兩種截然相反的作用：在嚴(yán)重感染過程中，機(jī)體通過降低Cyp4a14的表達(dá)達(dá)到自身穩(wěn)態(tài)，在炎癥損害發(fā)生之前削弱或終止炎癥反應(yīng)，保護(hù)機(jī)體避免感染等損害；然而，減弱的炎癥反應(yīng)有利于細(xì)菌侵入機(jī)體逃避免疫系統(tǒng)的清除，進(jìn)而發(fā)展為更為嚴(yán)重的感染[15-17]。本研究結(jié)果顯示，WT對照組和KO對照組小鼠生長發(fā)育良好，體重增加；KO DSS組小鼠出現(xiàn)稀便、肛周潮濕現(xiàn)象，體重下降；WT DSS組小鼠出現(xiàn)精神萎靡、血水樣便，體重急劇下降。DAI評分、結(jié)腸長度、血便評分和組織病理學(xué)結(jié)果顯示：與KO對照組相比，KO DSS組小鼠DAI評分增高，結(jié)腸縮短，出現(xiàn)結(jié)腸血性內(nèi)容物，病理學(xué)呈輕度炎癥改變；WT DSS組小鼠與KO DSS組相比DAI評分進(jìn)一步增高，結(jié)腸縮短最多，出現(xiàn)全結(jié)腸血性腸內(nèi)容物小鼠增多，病理學(xué)呈嚴(yán)重炎癥改變。以上各方面結(jié)果顯示Cyp4a14基因敲除后小鼠對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎反應(yīng)敏感性下降，說明Cyp4a14基因的缺失會減輕小鼠結(jié)腸的炎癥反應(yīng)，與以往研究[17]結(jié)果一致。

腸道是人體最大的細(xì)菌儲存器官和病原微生物、毒素侵入機(jī)體的主要門戶，杯狀細(xì)胞是腸上皮中的黏液分泌細(xì)胞，其分泌的黏液可發(fā)揮保護(hù)和潤滑腸道的作用，是形成腸黏膜屏障的重要組成部分[18]。有研究[19-20]顯示，寄生蟲感染的小鼠結(jié)腸中IL-13和IL-14可導(dǎo)致杯狀細(xì)胞病理性增生和黏蛋白過度分泌。當(dāng)外界有病原體進(jìn)入時，腸道做出應(yīng)激反應(yīng)，杯狀細(xì)胞分泌黏液量增加，隨著病程的發(fā)展，細(xì)胞數(shù)量逐漸下降，分泌能力也將下降，使腸道抵抗外界侵襲的能力減弱[21-22]。本研究中發(fā)現(xiàn)，KO DSS組小鼠結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞數(shù)量多于WT DSS組，可能正是由于杯狀細(xì)胞數(shù)量的增加，使KO DSS組小鼠結(jié)腸炎癥反應(yīng)輕于WT DSS組小鼠。

炎癥性腸病患者及動物模型中腸道黏膜ROS及RNS產(chǎn)生均增加，且ROS常在疾病早期階段出現(xiàn)，與疾病的嚴(yán)重程度及進(jìn)展均有關(guān)[23]。ROS可以激活NF-κB，介導(dǎo)產(chǎn)生大量炎癥因子，如 IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ等，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[24-26]。本研究中，在DSS誘導(dǎo)下，結(jié)腸和肝臟組織中IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)均增加，且在結(jié)腸組織中的表達(dá)量均高于肝臟，尤其以IL-6為著。本研究中還發(fā)現(xiàn)，在KO和WT小鼠結(jié)腸組織中均檢測不到Cyp4a14的表達(dá)，Cyp4a14主要表達(dá)在肝臟中。以上結(jié)果提示，肝臟組織中促炎因子的增加可能是通過肝腸循環(huán)由腸道炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)而來。

總之，Cyp4a14基因的缺失對小鼠結(jié)腸炎癥的發(fā)生具有一定的保護(hù)作用。這可能是由于Cyp4a14基因敲除影響了小鼠結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞的分化，使腸道內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)量增多，從而加強(qiáng)了腸道對外界刺激的抵抗能力。但Cyp4a14基因影響小鼠結(jié)腸組織杯狀細(xì)胞分化的具體機(jī)制仍不十分清楚，尚需進(jìn)一步研究。